温度敏感壳聚糖—接枝-NIPAAm/VL共聚物转基因载体

论文摘要

本论文主要研究了温度敏感壳聚糖（CS）-接枝-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）/ 月桂酸乙烯酯（VL）共聚物（PNVLCS）的制备,及其与DNA形成聚电解质复合物的性质以及此复合物介导的基因转染,主要内容包括以下三个方面: 1)对壳聚糖进行改性,制备出温度敏感壳聚糖-接枝-NIPAAm/VL共聚物,并以多种手段考察PNVLCS的物化性能。通过红外光谱和1H NMR谱确认共聚物的结构,并以GPC测定产物的分子量,浊度法和DSC实验揭示共聚物水溶液具有温度响应性,LCST大约为26℃。2)通过多种物理化学方法对共聚物PNVLCS/DNA复合物进行研究,考察PNVLCS与DNA的相互作用、复合物中DNA的构象变化和复合物的粒径以及温度对其的影响。通过31P NMR谱和圆二色谱的分析得知,DNA在与载体形成聚电解质复合物时引起价键的微小扰动,DNA由B型构象转变为C型构象,PNVLCS倾向于结合到DNA的小沟区域。变温UV和变温CD实验证实,在温度升高跨越LCST时,载体发生相转变使得与DNA之间的相互作用加强,结合更加紧密。对PNVLCS/DNA复合物的TEM的观测和动态光散射测试表明,DNA复合物的粒径因电荷比的不同而异,在高电荷比时可形成尺寸较小的纳米尺度颗粒,复合物的形态基本呈现均一的小球状。复合物的电泳实验揭示,PNVLCS可与DNA形成复合物,相比较而言,37℃条件下形成的复合物更稳定,能够更显著地限制DNA的移动。3)以C2C12小鼠成肌细胞为宿主细胞,以壳聚糖和共聚物PNVLCS为载体,介导含β-半乳糖苷酶报告基因质粒的转染,通过测定表达β-半乳糖苷酶的活性以确定基因转染效率,考察温度对转染率的影响。结果表明,PNVLCS可成功地将pTracerTM-CMV/Bsd/lacZ Vector质粒转入C2C12细胞内,壳聚糖载体的转染效率比裸DNA转染效率高4-5倍,而PNVLCS的转染效率可通过调控转染介质的温度而进一步提高,成功地实现了对转染效率的温度可控性。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 非病毒转基因载体
• 1.2.1 脂质体
• 1.2.2 聚乙烯亚胺（PEI）
• 1.2.2.1 PEI/DNA 复合物从内涵体中的释放
• 1.2.2.2 PEI-半乳糖载体
• 1.2.2.3 PEI-RGD 载体
• 1.2.3 壳聚糖
• 1.2.3.1 脱氧胆酸改性的壳聚糖衍生物
• 1.2.3.2 棕榈酰化改性的壳聚糖衍生物
• 1.2.3.3 烷基化壳聚糖（ACS）衍生物
• 1.2.3.4 其他壳聚糖衍生物
• 1.2.4 温度响应性转基因载体
• 1.2.4.1 聚异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）基载体
• 1.2.4.2 热敏脂质体
• 1.2.5 其它非病毒载体
• 1.2.5.1 聚-L-赖氨酸（PLL）介导的基因释放系统
• 1.2.5.2 树状高分子载体
• 1.2.5.3 基于抗体的靶向基因传递系统
• 1.3 论文工作的提出
• 第二章 温度敏感壳聚糖-接枝-NIPAAm/VL 共聚物转基因载体的制备与表征
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 原料
• 2.2.2 PNVLCS 共聚物的制备
• 2.2.3 PNVLCS 共聚物的表征
• 2.2.3.1 傅立叶转换红外光谱（FTIR）
• 2.2.3.2 凝胶渗透色谱（GPC）
• 1H NMR）'>2.2.3.3 核磁共振（¹H NMR）
• 2.2.3.4 共聚物溶液的LCST 测定
• 2.2.3.5 差示扫描量热（DSC）
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 红外光谱分析
• 2.3.2 共聚物分子量及分布分析
• 2.3.3 核磁共振分析
• 2.3.4 共聚物溶液的温度敏感性分析
• 2.4 结论
• 第三章 温度敏感 PNVLCS 共聚物/DNA 复合物的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 原料
• 3.2.2 复合物的表征
• 3.2.2.1 核磁共振（NMR）
• 3.2.2.2 透射电镜（TEM）
• 3.2.2.3 动态光散射（DLS）
• 3.2.2.4 荧光光谱
• 3.2.2.5 圆二色谱（CD）
• 3.2.2.6 变温UV 检测
• 3.2.2.7 复合物电泳
• 3.3 结果与讨论
• 31P-NMR谱分析'>3.3.1 核磁共振³¹P-NMR谱分析
• 3.3.2 TEM 观测
• 3.3.3 动态光散射分析
• 3.3.4 复合物荧光光谱分析
• 3.3.5 CD 分析
• 3.3.6 紫外分析
• 3.3.7 变温电泳分析
• 3.4 结论
• 第四章 温度敏感 PNVLCS 共聚物介导基因转染的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂耗材
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 菌体的培养与质粒的提取纯化
• 4.2.3.1 试剂配制
• 4.2.3.2 操作
• 4.2.3.3 质粒 DNA 的大量提取
• 4.2.4 C2C12细胞的培养
• 4.2.4.1 培养用液的制备
• 4.2.4.2 操作
• 4.2.5 质粒体外转染C2C12细胞
• 4.2.5.1 壳聚糖及温度敏感 PNVLCS/DNA 复合物的形成
• 4.2.5.2 细胞转染
• 4.2.6 β-半乳糖苷酶活性分析
• 4.2.6.1 使用报告裂解缓冲液（RLB）制备细胞裂解液
• 4.2.6.2 绘制标准曲线
• 4.2.6.3 BCA 法测蛋白
• 4.3 结果与讨论
• 4.4 结论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间完成的学术论文
• 致 谢