论文摘要
背景:现有血瘀证（blood stasis syndrome,BSS）动物模型以生物化学和生物物理等改变为评价依据,忽视生物表征所表达的血瘀病理变化的整体反映状态,如舌暗或瘀斑等符合人体血瘀证临床表现的指标。这在一定程度上又制约着血瘀证及其活血化瘀疗法研究的深入和临床应用。为此,本课题组提出了证候表征模型概念,并初步建立了寒凝血瘀证候表征模型,但脑缺血叠加寒冷诱导的病证结合表征模型尚未探讨。目的:本研究旨在建立脑缺血叠加寒冷诱导血瘀证表征模型,并再此基础上探索其生物学基础。方法:采用反复冰水冷冻法诱导寒凝血瘀证大鼠表征模型;采用大脑中动脉闭塞（MCAO）、双侧颈总动脉（BCCA）结扎、单侧颈总动脉（UCCA）结扎3种脑缺血诱导血瘀证大鼠表征模型;在比较三种模型表征基础上,选择一种稳定性、显示度和时间窗都优的模型,用于病证结合造模,即大脑中动脉闭塞叠加寒冷诱导血瘀证大鼠表征模型。表征测量方法有图像采集分析技术观察模型大鼠血瘀证生物表征的变化,并进行舌质色度值分析,采用吉量通用自动活动箱和自发活动（开场）视频分析系统进行大鼠行为学测试分析、同时采用放射免疫分析法测定血浆TXB2、6-Keto-PGF1a含量、酶联免疫吸附法测试血清tPA、PAI、sVCAM-1、GMP-140含量、免疫组化法测定脑组织海马IL-1、ICAM-1、Integrinβ1表达阳性细胞总面积和积分光密度值和电镜观察舌、脑组织微血管的病理变化等,并分析其与血瘀表证证候的相关性。结果:1.寒凝血瘀证表征模型大鼠舌质紫暗,舌下脉络增粗增长,与正常大鼠舌质鲜红润泽、舌下脉络清晰有明显差异（P＜0.05）。脑缺血后3、5dMCAO组、BCCA组与正常组大鼠的舌质色度值比较存在统计学差异（P＜0.05）;MCAO组脑缺血后3d大鼠舌下脉络显色长短分级计分均值（1.44±0.08）高于正常组均值（0.56±0.53）,统计学有差异（P＜0.05）。2.脑缺血后3dMCAO组、冰水组与脑缺血叠加寒冷组大鼠的舌质色度值与正常组比较均存在统计学差异（P＜0.05）;脑缺血后3d脑缺血叠加冰水组舌质色度值为各时间点最高值（舌质色度值60.12±5.154）。各组血液流变学统计结果显示,MCAO组、冰水冷冻组、冰水+MCAO组全血及还原黏度、血球压积、血浆黏度、聚集指数、变形指数均较正常组升高,部分时间点值升高与正常组比较有统计学差异（P＜0.01,P＜0.05）,其中又以冰水+MCAO组脑缺血后3d血液黏度、血球压积、血浆黏度、聚集指数均为各组最高值,变形指数为各组最低值。MCAO组、冰水冷冻组、冰水+MCAO组血浆TXB2含量均较正常组升高,部分时间点值升高与正常组比较有统计学差异（P＜0.01,P＜0.05）,其中又以冰水+MCAO组脑缺血后3d血浆TXB2（184.7±97.12）增加最明显。冰水冷冻组造模后3d血浆6-Keto-PGF1a含量（147.7±16.32）最低,冰水+MCAO组脑缺血后3d血浆TXB2/6-Keto-PGF1a比值（1.22±0.648）最高,其与正常组比较均有统计学差异（P＜0.05）。3.脑缺血叠加冰水冷冻组大鼠的生物表征（客观化指标包括舌质色度值、舌下脉络显色长短分级计分、大鼠活动时间及活动速度）与血液流变学指标、血浆TXB2、6-Keto-PGF1a含量、血清tPA、PAI、sVCAM-1、GMP-140含量、脑组织海马IL-1、ICAM-1、Integrinβ1表达阳性细胞总面积和积分光密度值均存在相关性,脑缺血叠加冰水组大鼠舌、脑组织的微血管电镜病理变化最明显。结论:大脑中动脉闭塞叠加寒冷模型是目前诱导血瘀证表征模型的最佳方法。单纯MCAO或单一寒冷刺激所诱导的血瘀证表征模型在稳定性、显示度等方面不及脑缺血叠加寒冷法。血液流变学,血浆TXB2、6-Keto-PGF1a,血清tPA、PAI、sVCAM-1、GMP-140,脑组织内IL-1、ICAM-1、Integrinβ1表达阳性细胞总面积和积分光密度值以及舌、海马微血管病理变化与血瘀证表征具有显著相关性,为血瘀证模型建立提供了方法学。