水稻密穗突变体的基因定位及幼穗特异表达启动子的分离

论文摘要

水稻(Oryza sativa L.)是全球最重要的粮食作物之一,其高产育种日益受到人们的重视。由于基因组小、生长周期相对较短等特点,水稻是禾本科作物基因组研究的重要模式作物,对其开展遗传学研究具有重要意义。本研究通过图位克隆技术对水稻密穗突变体进行了基因定位,同时分离了水稻幼穗特异表达启动子。全文主要概述如下：1.从粳稻品种中花11组织培养后代中发现了一个密穗突变体(dense panicle,dp1),表现为穗长变短,着粒密度显著增加等特点,对其后代进行遗传分析和表型鉴定,显示出该突变体受一对不完全显性基因控制。利用密穗突变体为母本与籼稻品种龙特甫B杂交构建F2分离群体,将密穗突变体基因定位在第2染色体标记STS98和STS117之间的19kb区间内。通过Rice Genome Annotation (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)预测此区域只有1个基因LOC_Os02g32960,编码一个未知的保守蛋白,未发现与已知穗型发育相关的基因同源,表明DP1为一新基因。对基因功能进一步验证将有助于水稻高产育种研究。2.利用水稻表达数据库筛选了20个可能具有水稻幼穗特异表达特性的基因,分离了它们的启动子,将候选启动子克隆出来连接pCAMBIA1391Z载体并转化到中花11愈伤组织中,在植株成熟后对各个组织进行GUS染色,分析候选启动子的表达模式。结果筛选到了PS01和PS13两个具有幼穗特异表达的启动子。运用GateWay技术将PS01和PS13两个载体的缺失片段连接到pGW载体中,构建启动子系列缺失载体并转化中花11愈伤组织,分析启动子调控元件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 水稻花序发育研究概况
• 1.1.1 水稻花序发育研究的意义
• 1.1.2 穗型分类
• 1.1.3 水稻花序发育过程
• 1.1.4 花的发育过程
• 1.1.4.1 水稻花的发育
• 1.1.4.2 水稻花器官发育的ABC模型
• 1.1.5 水稻花序发育的相关突变体
• 1.2 水稻启动子研究进展
• 1.2.1 真核基因表达调控的特点
• 1.2.2 转录水平基因表达调控
• 1.2.2.1 染色质结构与基因的表达调控
• 1.2.2.2 组蛋白甲基化与基因的表达调控
• 1.2.2.3 DNA甲基化与基因的表达调控
• 1.2.2.4 microRNA和siRNA介导的基因表达调控
• 1.2.3 启动子研究现状
• 1.2.3.1 真核生物启动子简介
• 1.2.3.2 启动子的分类
• 1.2.3.3 水稻启动子研究进展
• 1.2.3.3.1 水稻组成型启动子
• 1.2.3.3.2 水稻组织特异性启动子
• 1.2.3.3.3 水稻诱导型启动子
• 第二章 水稻密穗突变体的基因克隆
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 突变体材料
• 2.2.2 突变体的表型鉴定
• 2.2.3 遗传分析和定位群体构建
• 2.2.4 水稻DNA的提取
• 2.2.5 混合基因池的构建
• 2.2.6 PCR扩增
• 2.2.7 琼脂糖电泳检测
• 2.2.8 基因定位
• 2.2.9 新标记的发展
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 dp1突变体的形态特征与性状分析
• 2.3.2 dp1突变体的遗传分析
• 2.3.3 DP1基因的初定位
• 2.3.4 DP1基因的精细定位
• 2.3.5 基因预测
• 2.4 讨论
• 第三章 水稻幼穗特异表达启动子的分离
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 转化受体材料
• 3.2.3 生化试剂及试剂盒
• 3.2.4 引物合成
• 3.2.5 测序
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 花特异性启动子的分离
• 3.3.1.1 候选启动子的筛选
• 3.3.1.2 候选启动子的扩增
• 3.3.1.3 酶切与连接
• 3.3.1.4 大肠杆菌超级感受态的制备及质粒的转化
• 3.3.1.5 提质粒酶切验证
• 3.3.1.6 农杆菌电击感受态的制备及质粒转化
• 3.3.1.7 进一步验证
• 3.3.2 转基因植物的获得及其鉴定
• 3.3.2.1 转基因苗的获得
• 3.3.2.2 转基因苗的鉴定
• 3.3.3 候选启动子表达模式分析
• 3.3.4 组织特异性启动子的分析
• 3.3.4.1 特异性启动子元件分析
• 3.3.4.2 运用GateWay技术构建特异启动子的缺失载体
• 3.3.4.2.1 缺失载体的扩增
• 3.3.4.2.2 缺失片段的割胶回收
• 3.3.4.2.3 目的片段的连接
• 3.3.4.2.4 TOPO载体的转化
• 3.3.4.2.5 TOPO质粒载体的重组
• 3.3.4.2.6 电击转化农杆菌
• 3.3.4.3 缺失载体的转化和鉴定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 表达数据库筛选结果
• 3.4.2 候选启动子相关信息
• 3.4.3 所构载体的验证结果
• 3.4.4 水稻转基因结果及检测
• 3.4.5 候选启动子表达模式分析
• 3.4.6 缺失载体的构建
• 3.4.6.1 候选启动子的元件分析
• 3.4.6.2 缺失片段的引物设计及PCR扩增结果
• 3.4.6.3 运用GateWay技术构建缺失载体并鉴定
• 3.4.6.4 缺失载体的遗传转化
• 3.5 讨论
• 第四章 全文总结
• 4.1 本研究的意义和结果
• 4.2 研究的主要创新之处
• 4.3 进一步研究设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 已发表的学术论文