小鼠骨髓内皮细胞条件培养液活性成分对骨髓MSC体外增殖的影响

论文摘要

干细胞增殖和分化的调控是当前生物学和医学研究的一个重要方向。成功利用干细胞需要阐明干细胞增殖和分化的调控机制，以对它们进行有效的体外操作和体内干预。骨髓间充质干细胞（MSC）是一类成体多能干细胞。骨髓微环境通过多种方式调控造血谱系和非造血谱系细胞的生物学行为。骨髓内皮细胞是参与组成骨髓微环境的一种重要的基质细胞，它们与MSC在骨髓组织发育中和组织定位上有着密切的关系，所分泌的多种细胞因子可能对骨髓MSC生物学行为的调控起着重要作用。目前，关于骨髓内皮细胞生物活性产物调控骨髓MSC增殖和分化的研究甚少。本文的工作旨在利用小鼠骨髓内皮细胞系，研究其分泌的生物活性因子对体外培养条件下骨髓MSC增殖的影响，为阐明骨髓内皮细胞在骨髓MSC生长中的调控作用提供实验证据。本研究在鉴定小鼠骨髓内皮细胞系生物学特性的基础上，收集小鼠骨髓内皮细胞系无血清条件培养液（mBMEC-CM），使用相对分子质量（RMM）截留值为3000超滤膜对mBMEC-CM进行组分分离，获得超滤保留组分（称为RMM＞3000组分）和滤出组分（称为RMM＜3000组分）。进行原代骨髓MSC集落形成实验，并通过分离、纯化及传代培养骨髓MSC，在培养体系中加入mBMEC-CM原液及其RMM＞3000组分和RMM＜3000组分，以MSC集落形成率和MTT比色读数为指标，观察了小鼠骨髓MSC谱系细胞的增殖反应。用Western blot检测RMM＞3000组分中的转化生长因子-β1（TGF-β1），以重组小鼠TGF-β1为阳性对照，结合抗TGF-β1抗体的使用，进行集落形成实验、MTT比色试验、分裂指数测定和细胞周期分析，进一步研究了小鼠骨髓内皮细胞生物活性产物影响MSC谱系细胞体外增殖的机理。本文的实验结果显示，mBMEC-CM原液及其RMM＞3000组分和RMM＜3000组分均能抑制小鼠骨髓原代MSC集落的形成，且RMM＞3000组分的抑制作用最为显著，其最大效应浓度为20％（终体积分数）；而对传代第3代的小鼠骨髓MSC，三者均无显著影响。在RMM＞3000组分中检测到TGF-β1。抗TGF-β1抗体能减低RMM＞3000组分对原代MSC集落形成的抑制作用，使集落生成数增加。RMM＞3000组分能显著降低原代MSC谱系细胞的分裂指数，并使其G0／G1期细胞比例显著增加，S+G2／M期细胞比例显著减少，而对传代第3代MSC谱系细胞没有这些效应。总之，本研究结果表明，小鼠骨髓内皮细胞能分泌一种以上的生物活性因子，TGF-β1是其中的一种因子，它们对原代骨髓MSC的体外增殖有抑制作用，这种抑制作用是剂量依赖性的，能阻止小鼠骨髓原代MSC进入S期，减慢其细胞周期进程。这些结果为阐明骨髓MSC生长调控机制增添了新的实验证据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要缩略词
• 前言
• 1. 骨髓间充质干细胞
• 2. 骨髓内皮细胞
• 3. 本研究的目的和技术路线
• 第一部分 小鼠骨髓内皮细胞系长期传代培养和生物学特性鉴定
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二部分 小鼠骨髓内皮细胞条件培养液成分对骨髓 MSC体外增殖的影响
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三部分 mBMEC-CM活性成分抑制骨髓 MSC体外增殖的机理研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 攻读学位期间发表论文情况
• 致谢