秀丽线虫核酸酶Dicer在细胞凋亡中功能转变的机制研究

论文摘要

Dicer蛋白属于核糖核酸酶III（ribonuclease III，RNase III）家族中的重要成员，可以切割双链RNA（dsRNA）引发基因沉默。线虫中的Dicer蛋白DCR-1，在发生细胞凋亡时，被半胱天冬蛋白酶家族成员CED-3从RNase IIIa结构域中间切断，生成具有脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）功能的C端产物tDCR-1，能够将染色体DNA切出3’羟基缺口，从而启动细胞凋亡中染色体DNA的降解过程。DCR-1蛋白在CED-3激活下发生的由RNase向DNase的功能转变，保证了细胞凋亡过程的顺利进行，是细胞内调控的关键步骤。然而，关于这一过程的详尽的分子机制仍未得到解析。因此，本论文综合运用生物化学和分子遗传学手段，并结合结构模拟，对DCR-1蛋白功能转变的机制进行了详细的研究。首先，我们通过体内外DNase活性检测实验，发现tDCR-1N端的多数结构域对于抑制它的活性并不是必需的，并找到了起抑制作用的关键临界区域--20个氨基酸组成的α螺旋。通过对该区域进行不同二级结构的序列替换实验，我们发现这段序列对tDCR-1DNase活性的抑制是结构依赖性的而非序列特异性的。其次，我们还通过DCR-1与DNA的结合实验，发现tDCR-1活性的获得是由于CED-3激活了其与B-form DNA结合的能力，剩余的半个RNase IIIa结构域正是负责与DNA结合的关键区域。而当DNA构象发生变化时，tDCR-1与底物结合或切割的能力就会消失，说明tDCR-1蛋白对底物的选择性主要依赖于底物DNA的构象。再次，我们对CED-3切前和切后的DCR-1蛋白进行了结构模拟，直观的阐明了CED-3的切割去除了阻碍DCR-1构象变化的空间位阻，形成了一个适合结合B-form DNA的沟槽；且由于位阻消失，DNA才得以进入沟槽。最后，我们还发现把细菌RNase III结构域替换到线虫tDCR-1RNase IIIb结构域的位置后，新的蛋白可以表现出像tDCR-1一样的DNase活性，这表明其他RNase III家族成员也具有切割DNA的潜能，当其与可以帮助它结合DNA的序列连接到一起时，潜能就会被发挥出来。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 细胞凋亡
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 细胞凋亡的特点
• 1.1.3 细胞凋亡的机制
• 1.1.4 细胞凋亡的意义
• 1.2 秀丽线虫-生物学研究理想的模式生物
• 1.2.1 秀丽线虫的生物学特性
• 1.2.2 秀丽线虫中细胞凋亡的特点和机制
• 1.3 染色体 DNA 降解的研究现状
• 1.3.1 DFF40 --最早被发现参与细胞凋亡的核酸酶
• 1.3.2 DCR-1 --线虫中启动 DNA 降解的关键核酸酶
• 1.3.3 EndoG/CPS-6 --线粒体中参与凋亡细胞 DNA 降解的核酸酶
• 1.3.4 CRN 家族
• 1.3.5 DNase II 家族核酸酶
• 1.3.6 线虫中染色体 DNA 降解的模型
• 1.3.7 染色体 DNA 降解异常导致的疾病
• 1.4 Dicer 核酸酶的研究现状
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 Dicer 蛋白 RNase 活性与结构的关系
• 1.4.3 线虫 DCR-1 蛋白在细胞凋亡中的功能转变
• 1.5 本文的研究目的和主要内容
• 第2章 具有 DNase 活性的 tDCR-1 蛋白制备条件摸索
• 2.1 本章引论
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 细胞
• 2.2.3 载体
• 2.2.4 试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 克隆构建
• 2.3.2 大肠杆菌表达与纯化
• 2.3.3 包涵体变复性方法
• 2.3.4 体外转录翻译系统表达纯化蛋白
• 2.3.5 昆虫细胞表达与纯化
• 2.3.6 蛋白电泳检测方法
• 2.3.7 DNase 活性的测定
• 2.3.8 CED-3 纯化与活性测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 大肠杆菌表达 tDCR-1 结果
• 2.4.2 tDCR-1 包涵体变复性结果
• 2.4.3 体外转录翻译系统表达 DCR-1 结果
• 2.4.4 昆虫细胞表达 tDCR-1 结果
• 2.4.5 小结
• 第3章 抑制 tDCR-1 活性的关键临界区域及抑制机理研究
• 3.1 本章引论
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 线虫
• 3.2.2 载体
• 3.2.3 试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 克隆构建
• 3.3.2 体外转录翻译系统表达蛋白
• 3.3.3 DNase 活性测定
• 3.3.4 体外 TUNEL 实验
• 3.3.5 显微注射构建转基因线虫
• 3.3.6 体内细胞死亡数目检测
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 N 端各结构域对 tDCR-1 蛋白 DNase 活性抑制效果分析
• 3.4.2 抑制 tDCR-1 DNase 活性的关键临界区域鉴定
• 3.4.3 二级结构依赖的抑制机理分析
• 3.4.4 其他不相关序列对 tDCR-1 蛋白 DNase 活性的抑制
• 3.4.5 小结
• 第4章 CED-3 激活的 DCR-1 蛋白与 DNA 结合能力分析
• 4.1 本章引论
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 克隆构建
• 4.3.2 昆虫细胞表达纯化蛋白
• 4.3.3 凝胶迁移法（EMSA）检测双链 DNA 的结合
• 4.3.4 Pull down 法检测与质粒 DNA 的结合
• 4.3.5 拓扑异构酶 I 处理超螺旋质粒 DNA
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 DCR-1 蛋白与短链 dsDNA 的结合
• 4.4.2 DCR-1 蛋白与超螺旋质粒 DNA 的结合
• 4.4.3 DNA 的构象对 DCR-1 活性的影响
• 4.4.4 DCR-1 蛋白结合 DNA 的区域鉴定
• 4.4.5 小结
• 第5章 通过结构模拟探讨 DCR-1 蛋白功能转变的机制
• 5.1 本章引论
• 5.2 实验材料
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 结构建模
• 5.3.2 RNase 活性检测
• 5.3.3 新 RNase III 克隆构建
• 5.4 结果
• 5.4.1 结构建模结果
• 5.4.2 RNase 活性检测结果
• 5.4.3 新 RNase III 蛋白 DNase 活性检测结果
• 5.5 讨论
• 第6章 论文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 常用试剂和储液配制方法
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果