高效废水处理生物反应器中优势功能菌的分子识别与鉴定

论文摘要

微生物分子生态学发展的一个重要的方面是对尚未得到纯培养的微生物的分类地位与其功能进行关联,从而得到这些微生物的功能信息。随着分子生物学的发展,通过对16S rRNA基因等具有进化标记的基因的克隆和测序,越来越多的不可培养的微生物被发现,同时,大量研究发现微生物区系的组成和功能通常会随着环境的变化而同时发生变化。我们可以根据这一模式深入了解微生物区系的结构与功能动态变化情况,并鉴定主要的功能菌。随着人们环保意识增强,可持续发展观念的理解深入,人们对难降解有机物在环境中的降解、迁移及危害越来越关注并开发出了很多高效的去除这些有机物的方法。然而,在很多生物处理的工艺中,人们对处理过程的生物降解机理并不是很清楚,对处理过程的微生物的区系结构及主要的功能菌也知之甚少。在本研究中,首先对处理含有高浓度喹啉废水的反应器进行了解析,喹啉是一种主要的含氮杂环化合物,是存在于一些水体和某些土壤中的主要的污染有机物之一,在工业废水处理过程中,喹啉是一种常见的难降解的复杂有机物之一。实验中反硝化生物膜反应器和一个平行的厌氧反应器是从同一份种子污泥出发驯化建立的。两个反应器的其它条件完全一致,只是在反硝化反应器中加入了一定量的硝酸根。经过六个星期的驯化,两个反应器均达到了稳定运行状态。经过五天的连续监测,在反硝化反应器中喹啉的平均去除率为90.2%,COD的平均去除率为81.1%,而厌氧反应器中为喹啉平均去除率为53.6%,COD的平均去除率60.4%。为了找出反硝化条件下及厌氧条件下的主要功能菌,我们对种子污泥、反硝化反应器和厌氧反应器中生物膜样品的微生物种群进行了对比分析。首先通过16S rRNA v3区基因的PCR-DGGE分析,对种子污泥和两个反应器中的微生物组成进行了对比。通过对比发现样品的微生物区系组成有很大的差异,表明种子污泥在含喹啉的合成废水中进行驯化时,其微生物组成发生了很大的变化,其中那些能在反硝化和厌氧条件下降解喹啉的微生物被富集。对其中的优势条带进行割胶,克隆测序分析表明在反硝化反应器中的最优势的条带所代表的序列与Thauera和Azoarcus属的微生物具有很近的亲缘关系。而在厌氧反应器中变形菌纲Gamma亚纲与Desulfobacter postgatei种的微生物是优势的条带。同时我们还构建了16S rDNA的全长序列的克隆文库。根据Kemp,P.F.等人的方法对所建文库的有效性进行了验证,结果表明三个文库均已足够大。通过两个统计学参数Shannon Wiener index （H）和reciprocal of Simpson’s index （1/D）分析表明三个文库的多样性顺序为SS>DR>AR。说明在驯化过程中微生物的多样性降低了。通过对克隆文库进行进化地位分析表明,在反硝化反应器中,所有的Phylotype均属于变形菌纲Beta亚纲,而种子污泥中的克隆分属于8个纲。其中反硝化反应器中73.6%的克隆与Thauera和Azoarcus属的微生物具有最高的同源性。而在种子污泥中,与这两个属同源性最高的微生物只有4%,在厌氧反应器的克隆文库中没有发现属于这两个属的微生物。厌氧反应器中变形菌纲Gamma亚纲与Desulfobacter postgatei种的微生物显著增加,这种动态变化表明这些细菌可能是在反硝化和厌氧条件下对喹啉的降解起关键作用的微生物。为了进一步定量的验证所得到的结果,我们应用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, RTQ-PCR）的方法,选取了专一性的针对Thauera和Azoarcus属微生物的引物。对降解喹啉的反硝化反应器的种子污泥样品和稳定运行后的生物膜样品进行了定量分析。结果表明在每微克湿重的污泥中待检测的基因片段的拷贝数在种子污泥中为为3.70±0.16×105,在反硝化反应器中为3.69±0.97×106。这表明在驯化过程中,Thauera和Azoarcus属微生物的细胞数增加了一个数量级。也进一步表明了,这两个属的微生物很有可能是在反硝化条件下的去除复杂有机物的重要的功能菌。用类似的方法我们分析了以焦化废水为底物的两个反应器,系统运行稳定后,GC/MS分析表明,苯酚、甲苯、嘧啶在DR中的去除效率较高,而咔唑和苯胺在AR中具有更高的去除效率。反硝化装置中的平均COD去除率为51.4%,厌氧反应器中为18.3%。PCR-DGGE分析和克隆文库分析都表明,两个反应器中发生了不同的微生物区系变化,在反硝化反应器内,Thauera属的微生物发展成为优势菌群。这与喹啉部分的实验结果吻合。在厌氧反应器中最优势的微生物与一个未鉴定的硫酸盐还原菌具有最高的同源性。在本研究中,通过对系统中的微生物区系结构进行动态监测,与反应器的整体功能变化相关联,在分子水平上鉴定了厌氧和反硝化条件下降解喹啉及焦化废水的优势功能菌类群。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 微生物分子生态学及其研究策略
• 1.1.1 微生物生态系统的特性
• 1.1.2 微生物分子生态学的研究目的
• 1.1.3 微生物分子生态学的研究技术
• 1.1.4 微生物分子生态学的研究策略
• 1.1.5 微生物分子生态学的研究主题
• 1.2 根据微生物区系的结构与功能的关系鉴定系统的功能菌类型
• 1.2.1 根据功能不同的平行系统的微生物区系结构差异鉴定重要的功能菌类型
• 1.2.2 根据微生物区系的结构与功能的动态变化关系鉴定重要的功能菌类型
• 1.2.3 根据活性微生物组成的动态变化与系统的功能相关联鉴定功能菌
• 1.3 反硝化细菌的研究现状及其在废水处理中的应用
• 1.3.1 反硝化微生物的研究状况
• 1.3.2 硝酸和碳源对反硝化过程的影响
• 1.3.3 以复杂有机物为碳源的反硝化过程
• 1.4 本研究的策略
• 1.5 参考文献
• 第二章 处理含有喹啉的人工合成废水的厌氧和反硝化反应器中微生物区系的解析及主要功能菌类型的鉴定
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 反应器运行状况
• 2.1.2 样品预处理和DNA 提取
• 2.1.3 16S rRNA 基因v3 区PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 2.1.4 16S rRNA 基因全长扩增，克隆文库构建
• 2.1.5 克隆文库的测序及序列分析
• 2.1.6 实时荧光定量PCR
• 2.1.7 核酸序列登录号（Accession number）
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 反应器的运行状况
• 2.2.2 PCR-DGGE 指纹图谱分析
• 2.2.3 16S rRNA 基因克隆文库的序列分析
• 2.2.4 通过LIBSHUFF 软件对三个文库进行对比
• 2.2.5 16S rRNA 基因文库的组成分析
• 2.2.6 实时荧光定量PCR
• 2.3 讨论
• 2.3.1 本实验所用的方法及结果
• 2.3.2 难降解有机物的降解机理研究
• 2.3.2 降解复杂有机物的重要反硝化菌Thauera 和Azoarcus 属微生物的研究现状
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 处理焦化废水的厌氧和反硝化反应器的微生物区系结构解析及优势功能菌类型的鉴定
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 反应器运行状况
• 3.1.2 样品的收集和DNA 提取
• 3.1.3 16S rRNA 基因v3 区PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 3.1.4 16S rRNA 基因克隆文库分析
• 3.1.5 克隆文库序列统计学分析及进化地位分析
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 反应器运行状况
• 3.2.2 16S rRNA 基因v3 区的PCR-DGGE 分析
• 3.2.3 ∫-LIBSHUFF 对文库进行对比分析
• 3.2.4 16S rRNA 基因克隆文库分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 以焦化废水作为研究对象具有重要的生态意义
• 3.3.2 本章实验结果讨论
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 本研究的创新性
• 附录1. 简称缩写
• 附录2. 溶液试剂及培养基
• 附录3. 实验中所用的仪器设备
• 致谢
• 已（待）发表的学术文章及参加的科研课题