鸭疫里氏杆菌双耐药融合菌株的构建

论文摘要

鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）病是由鸭疫里氏杆菌引起的一种侵害家鸭及其它家禽和野禽的接触性传染病。该病原在世界范围内分布,玻片凝集或试管凝集法可将鸭疫里氏杆菌分为21种血清型,由于RA各血清型之间缺乏有效的交叉保护,可引起免疫失败,严重危害养鸭业的发展。国内主要以血清型1型和2型较为常见,据此,我们选择鸭疫里氏杆菌血清1型（RA-JX株）和血清2型（RA-2株）菌株为试验菌株,采用原生质体融合技术构建双耐药RA融合菌株,为探索研制鸭疫里默氏杆菌病的新型疫苗奠定基础,现将主要结果报告如下。（1）通过药敏试验方法,分别选用氯霉素（Chl）和红霉素（Ery）对RA-JX菌株（1型）和RA-2菌株（2型）进行耐药性标记,在TSB液体培养基中采用逐级提高药物浓度的方法进行诱导培育,分别获得了遗传特性稳定的耐药性标记菌株RAC（Chlr,Erys）（1型）和RAE（Eryr,Chls）（2型）。其中RAE菌株对Ery耐受程度从起始诱导浓度16μg/mL提高到160μg/mL;RAC菌株对Chl耐受程度从起始诱导浓度为8μg/mL提高到80μg/mL。（2）以RAC菌株和RAE菌株为亲本出发菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备两亲本菌株原生质体。通过对溶菌酶-EDTA工作浓度及时间的优化,确定原生质体的最优反应条件,溶菌酶的适合浓度为5μg/mL,作用时间为25 min,EDTA浓度为0.01mol/L,作用时间为20 min。在此优化条件下,RAC菌株和RAE菌株原生质体制备率分别达到85%和81%,原生质体再生率分别达为43%和40%。（3）在40%PEG 4000促融作用下,进行RAC菌株原生质体和RAE菌株原生质体的融合,采用间接双抗平板选择法共筛选获得了8株融合菌株,即F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8。融合菌株对氯霉素和红霉素均具有耐药性,生长情况及形态染色、生化特性鉴定的结果与亲本菌株保持一致。通过对融合菌株进行耐药性稳定性试验,证明获得的融合菌株具备稳定的双亲耐药性。本研究通过原生质体融合,获得了耐药性稳定的融合菌株,鸭疫里氏杆菌血清1型和2型双耐药融合菌株的成功构建,为鸭疫里氏杆菌新型疫苗的开发及加强该病的防制奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATION）
• 1 文献综述
• 1.1 鸭疫里氏杆菌的研究历史
• 1.2 鸭疫里氏杆菌的病原学特征
• 1.2.1 病原学分类
• 1.2.2 血清型与分类地位
• 1.3 鸭疫里氏杆菌病的研究进展
• 1.3.1 流行病学
• 1.3.2 临床症状与病理表现
• 1.3.3 病原的检侧
• 1.3.4 分子生物学的研究
• 1.4 鸭疫里氏杆菌病的防治
• 1.5 细菌耐药的分子机制
• 1.5.1 药物作用靶位的改变
• 1.5.2 产生灭活酶或钝化酶
• 1.5.3 抗菌药物渗透障碍
• 1.5.4 代谢途径改变
• 1.5.5 生物膜的形成
• 1.6 原生质体融合技术
• 2+、pH诱导法'>1.6.1 化学法PEG结合高Ca²⁺、pH诱导法
• 1.6.2 物理法-电融合与激光诱导融合法
• 1.7 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂及溶液的配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗血清的制备
• 2.2.2 RA生长曲线的测定
• 2.2.3 药敏实验
• 2.2.4 耐药性菌株的培育
• 2.2.5 耐药性标记菌株的鉴定
• 2.2.6 原生质体融合技术构建鸭疫里氏杆菌双耐药融合菌株
• 2.2.7 融合菌株的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 RA抗血清的制备及应用
• 3.2 RA生长曲线的测定
• 3.3 药敏实验
• 3.3.1 耐药性标记药物的选择
• 3.3.2 RA-2菌株和RA-JX菌株最小抑菌浓度的测定
• 3.4 耐药性菌株的培育
• 3.5 耐药性标记菌株的鉴定
• 3.5.1 耐药性鉴定结果
• 3.5.2 生长情况及形态染色鉴定
• 3.5.3 生化特性试验鉴定
• 3.5.4 血清型鉴定
• 3.6 原生质体融合技术构建鸭疫里氏杆菌双耐药融合菌株
• 3.6.1 RAE菌株和RAC菌株生长曲线的测定
• 3.6.2 耐药性菌株原生质体的制备
• 3.6.3 融合菌株的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 鸭疫里氏杆菌的培养
• 4.2 耐药性标记药物的选择
• 4.3 耐药性菌株的培育
• 4.4 原生质体的制备及再生
• 4.5 原生质体的融合
• 4.6 融合菌株的筛选
• 4.7 未筛选到双价融合菌株的原因分析
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢