拟态弧菌OmpU抗原B细胞线性表位的筛选与鉴定

论文摘要

拟态弧菌（Vibrio mimicus,Vm）是一种水产养殖动物和人共患病病原菌。该菌不仅可引起水产养殖动物严重的腹水病，而且可通过水体和水产品感染人类，导致人类腹泻和食物中毒[1-6]。针对腹水病已成为制约水产养殖业健康发展的现状，开展该病快速诊断方法的研究以及研制其有效疫苗具有十分重要意义，而筛选出理想的侯选抗原或抗原表位则是急需解决的首要问题。本研究联合采用表位预测和实验验证方法对拟态弧菌OmpU蛋白B细胞线性表位进行筛选鉴定，并分析表位间的免疫活性差异，为建立基于抗原表位的快速诊断方法和研制表位疫苗奠定基础。首先，通过生物信息学软件DNAStar Protean综合分析OmpU蛋白的二级结构、柔性区域、表面可及性、亲水性和抗原指数，预测OmpU蛋白可能的B细胞线性表位。在应用Moe2008软件构建OmpU蛋白三维结构（3D）的基础上，利用Synchronize可视化程序将10个预测表位肽序列展示于OmpU蛋白3D结构上，筛选出位于3D结构表面的7个肽段作为最可能的B细胞线性表位，并进行生物合成，用于鉴定。其次，将OmpU蛋白主要抗原域基因OmpUa亚克隆至表达载体pAML-c4x中进行诱导表达与鉴定，分析重组蛋白的表达形式。根据pAML-c4x表达载体阅读框的要求，设计1对包含Sal I和Hind III酶切位点的特异引物，以拟态弧菌基因组DNA为模板，扩增OmpUa基因，将OmpUa基因克隆至pMD-18T载体中构建重组克隆质粒pMD-18T-OmpUa。pMD-18T-OmpUa经Sal I/Hind III双酶切后，将OmpUa基因亚克隆至表达载体pAML-c4x中构建重组表达质粒pAML-c4x-OmpUa，并转化至大肠杆菌TB1。基因工程重组菌pAML-c4x-OmpUa/TB1经IPTG诱导表达后，收集菌体蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定，SDS-PAGE结果显示出现一条与预期融合蛋白MBP-OmpUa相对分子量大小相同的浓染蛋白条带；Western-blot结果显示重组融合蛋白能被兔抗MBP抗体所识别。这些结果表明OmpUa基因在原核细胞中得到成功表达。基因工程重组菌pAML-c4x-OmpUa/TB1经16℃诱导表达后，分别提取胞内可溶性部分和包涵体进行SDS-PAGE分析，结果显示重组融合蛋白主要以可溶性形式表达。再次，以纯化的重组融合蛋白MBP-OmpUa为抗原制备特异性抗体。重组融合蛋白MBP-OmpUa经麦芽糖直链淀粉树脂纯化后，与双相乳化佐剂充分乳化制成免疫原，并按照一定的免疫程序免疫家兔制备兔抗MBP-OmpUa抗体。结果发现在免疫后第14天即可检测出血清特异性抗体，免疫后第28天血清抗体的ELISA效价达到1:4096000，琼扩效价达到1:32，完全可以满足后续实验的要求。最后，采用肽ELISA方法鉴定预测表位肽，分析不同表位间免疫反应性的大小。以40μg/ml预测表位肽及一个无关肽为包被抗原，以1:400稀释度的兔抗MBP-OmpU抗体、兔抗MBP抗体及阴性血清为一抗，1:7000浓度羊抗兔HRP-IgG为二抗，采用间接ELISA方法检测各预测表位肽的免疫反应性。结果显示7个预测表位肽均能与兔抗MBP-OmpUa抗体发生结合反应而不能与兔抗MBP抗体发生反应，而序列无关肽与上述两种抗体均不发生反应，表明7个预测表位肽均能被兔抗MBP-OmpUa抗体特异性识别，它们保留了天然OmpU蛋白的免疫反应性，是OmpU蛋白的真正表位。7个表位的免疫反应性大小依次为表位3（aa90-98）、表位4（aa239-250）、表位6（aa183-195）、表位2（aa117-126）、表位1（aa25-33）、表位5（aa173-180）和表位7（aa211-218）。综上所述，联合采用表位预测和实验验证方法首次筛选鉴定出拟态弧菌OmpU蛋白的7个B细胞线性表位。它们分别位于OmpU蛋白的25～33、56～66、90～98、100～106、117～125、173～180、184～192、211～218、239～250和284～295氨基酸区段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表目录
• 本论文常用中英文缩写词
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株与质粒载体
• 1.2 酶类与主要试剂（盒）
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要培养基与溶液的配制
• 1.4.1 LB培养基
• 1.4.2 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.4.3 制备感受态细胞所需溶液
• 1.4.4 蛋白电泳检测所需溶液
• 1.4.5 蛋白诱导表达及提纯所需溶液
• 1.4.6 Western-blot试验所用溶液
• 1.4.7 ELISA实验所需溶液
• 1.5 主要仪器
• 1.6 拟态弧菌OmpU蛋白B细胞线性表位的预测与筛选
• 1.6.1 OmpU蛋白B细胞线性表位的预测
• 1.6.2 OmpU蛋白三维结构的同源模建与B细胞线性表位筛选
• 1.7 OmpU蛋白主要抗原域基因的克隆
• 1.7.1 细菌基因组DNA的提取
• 1.7.2 OmpU蛋白主要抗原域基因的PCR扩增
• 1.7.3 PCR产物的胶回收与纯化
• 1.7.4 OmpUa基因与pMD-18T载体的连接与转化
• 1.8 重组表达质粒的构建与鉴定
• 1.8.1 克隆质粒pMD-18T-OmpUa与表达载体的双酶切
• 1.8.2 OmpUa与pAML-c4x的连接与转化
• 1.8.3 重组表达质粒的鉴定
• 1.9 重组表达质粒的表达与表达产物的鉴定
• 1.9.1 重组表达质粒的诱导表达
• 1.9.2 表达产物的鉴定
• 1.9.3 表达产物的表达形式分析
• 1.10 重组融合蛋白多克隆抗体的制备
• 1.10.1 重组融合蛋白的大量表达
• 1.10.2 重组融合蛋白的提纯
• 1.10.3 免疫原制备
• 1.10.4 实验兔免疫
• 1.10.5 间接ELISA法检测抗体水平
• 1.10.6 免疫琼脂扩散沉淀试验检测抗体水平
• 1.11 OmpU蛋白B细胞线性表位的鉴定
• 1.11.1 预测表位肽的生物合成
• 1.11.2 预测表位的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 拟态弧菌OmpU蛋白B细胞线性表位的预测与筛选
• 2.1.1 B细胞线性表位的预测
• 2.1.2 B细胞线性表位的筛选
• 2.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
• 2.3 重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.4 融合蛋白MBP-OmpUa的诱导表达与鉴定
• 2.5 重组融合蛋白的表达形式分析
• 2.6 重组融合蛋白的纯化
• 2.7 重组融合蛋白多克隆抗体的效价
• 2.8 OmpU蛋白优势B细胞线性表位鉴定
• 3 讨论
• 3.1 蛋白质三维结构的构建及其在表位预测中的应用
• 3.2 促进目的蛋白可溶性表达的方法
• 3.3 肽ELISA方法的建立
• 3.4 拟态弧菌OmpU蛋白抗原表位的研究意义
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介