论文题目: 1.通过基因工程技术培育高产优质水稻品系 2.草坪草高效遗传转化体系的建立
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 曹明霞
导师: 卫志明,黄健秋
关键词: 水稻遗传转化,根癌农杆菌,产量,抗除草剂,穿膜序列,重组酶,生物安全性
文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
发表年度: 2005
论文摘要: 两个增产相关基因[透明颤菌血红蛋白基因(VHb)和农杆菌玉米素合成酶基因(tzs)],一个抗除草剂草甘膦基因[突变的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因],一个报告基因(gus)和一个筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),各自形成独立的表达框串联在一个双元载体的T-DNA 区,利用根癌农杆菌介导,被同时导入水稻基因组。五个外源基因的共整合频率达到90.2%,共表达频率可达85%。外源基因以低拷贝(1-3)稳定地整合,并按孟德尔方式稳定遗传到转基因后代。基于多基因的共整合和共表达,大量的转基因水稻株系可用于田间实验和育种研究。田间实验结果表明转基因株系在株高、穗长、每穗总粒数和每穗实粒数的性状上和对照相比有显著性改良提高;转基因水稻植株获得了明显的对除草剂草甘膦的抗性。另外,从基因工程技术本身需要和生物安全性角度考虑,有必要去除转基因植株中的筛选标记基因。来源于成纤维细胞生长因子FGF-4的含12 个氨基酸的穿膜序列(MTS)用于介导Cre 重组酶进入水稻细胞,将设计在两个loxP 位点间的报告基因(gus)和潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)通过位点特异性重组从植物基因组中切除,结果得到只携带目的基因的转基因水稻,从而在一定程度上消除转基因作物的安全隐患,促进其的推广应用。
论文目录:
第一部分:通过基因工程技术培育高产优质水稻品系——利用根癌农杆菌介导的多基因转化技术培育高产水稻株系并通过cre-lox 系统去除其中的标记基因
论文中文摘要
论文英文摘要
第一章 综述:根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
引言
1 农杆菌介导水稻遗传转化研究的回顾
1.1 摸索阶段
1.2 技术突破和成熟阶段
1.3 应用阶段
2 影响农杆菌转化水稻的几个关键因素
2.1 转化受体
2.2 Vir 基因诱导物
2.3 农杆菌菌株及载体系统
2.4 培养基和激素
2.5 启动子
2.6 筛选剂
3 前景展望
3.1 标记基因的去除或改造
3.2 整株转化
3.3 多基因转化
3.4 定向转化
结束语
参考文献
第二章 通过根癌农杆菌介导的水稻多基因转化技术实现水稻产量提高和除草剂抗性的获得
引言
材料和方法
1 酶及生化试剂
2 水稻组织培养和遗传转化所用的培养基
3 细菌培养基
4 质粒和菌株
5 质粒 DNA 的提取、鉴定和转化
6 植物材料
7 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化和转基因水稻植株的再生
8 水稻叶片总 DNA 的微量和大量提取
9 聚合酶链式反应(PCR)分析
10 Southern blot 分析
11 水稻总 RNA 的提取
12 Northern blot 分析
13 潮霉素筛选
14 GUS 活性的组织化学鉴定
15 除草剂抗性测试
16 转基因在后代出现分离的鉴定(半粒种子测试)
17 转基因植株的表型分析
结果与讨论
1 产生大量表型正常并且可育的转基因水稻植株
2 外源基因的稳定整合
3 外源基因的稳定表达和遗传
4 转基因水稻株系的表型改良和产量提高
讨论
参考文献
第三章 利用能够穿透细胞膜的Cre重组酶切除转基因水稻中的筛选标记以及报告基因
引言
材料和方法
1 酶及生化试剂
2 细菌培养基
3 水稻组织培养和遗传转化所用的培养基
4 质粒和菌株
5 质粒 DNA 的提取、鉴定和转化
6 植物材料
7 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化和转基因水稻植株的再生
8 水稻叶片总 DNA 的微量和大量提取
9 聚合酶链式反应(PCR)分析
10 Southern blot 分析(使用地高辛-高效随机引物 DNA 标记和检测试剂盒Ⅱ)
11 潮霉素筛选
12 GUS 活性的组织化学鉴定
13 经 EHA105/pYP1203E 转化的转基因水稻植株的外源基因拷贝数的确定
14 穿膜重组酶 Cre 蛋白Hi56-NLS-Cre-MTS 的表达和纯化
15. 水稻细胞培养
16 水稻愈伤组织的预处理
17 融合蛋白Hi56-NLS-Cre-MTS处理水稻细胞和水稻植株的再生
18 检测水稻细胞中融合蛋白Hi56-NLS-Cre-MTS介导的DNA重组
结果
1 水稻遗传转化质粒pYF5091 的构建和质粒转化根癌农杆菌 EHA105
2 转基因植株(QiufengloxP)的产生
3 融合蛋白Hi56-NLS-Cre-MTS 介导的水稻细胞中的位点特异性重组和无筛选标记基因的转基因植株的产生
讨论
参考文献
论文第二部分草坪型多年生黑麦草(Lolium perenne)和高羊茅(Festuca arundinacea Schreb)高效再生体系和根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立
论文中文摘要
论文英文摘要
引言
材料和方法
1 酶及生化试剂
2 草坪草组织培养和遗传转化所用的培养基
3 细菌培养基
4 质粒和菌株
5 质粒 DNA 的提取、鉴定和转化
6 植物材料
7 根癌农杆菌介导的多年生黑麦草和高羊茅遗传转化和转基因植株的再生
8 多年生黑麦草和高羊茅叶片总 DNA 的微量和大量提取
9 聚合酶链式反应(PCR)分析
10 Southern blot 分析
11 GUS 活性的组织化学鉴定
结果与讨论
1 建立高效的多年生黑麦草和高羊茅的愈伤组织诱导和绿苗再生体系
1.1 成熟种子的不同预处理方式对愈伤组织诱导和植株再生的影响
1.2 基本培养基、pH 值和硅酸钠组分对愈伤组织的诱导和植株再生的影响
2 建立根癌农杆菌介导的多年生黑麦草和高羊茅的高效遗传转化体系
2.1 遗传转化受体
2.2 根癌农杆菌的感染条件以及共培养条件
2.3 恢复培养中的抗氧化剂的应用
2.4 筛选流程对遗传转化的作用
2.5 抗性苗的GUS组织化学鉴定
2.6 外源基因整合进多年生黑麦草和高羊茅基因组
参考文献
总结和展望
发表文章目录
致谢
发布时间: 2005-09-09
参考文献
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