三株鱼类细胞系的建立和十二株鱼类细胞系对重金属毒性的敏感性研究

论文摘要

水环境污染是全球关注的热点问题之一。全球每年都有大量的毒物通过各种途径进入水环境中,包括重金属在内的众多污染物对生物体都具有潜在的毒性。如果不能及时地发现毒物、检测其毒性以及对其潜在危害做出预测,那么极有可能造成严重的生态危机。因此建立灵敏、快速的生物检测体系对污染物的毒性进行早期预警和生态风险评估就显得极其重要。利用体外培养的细胞系作为体外模型进行污染物毒性检测的体外检测系统具有细胞均一性好、遗传相似、反应速度快、经济、方便等众多优点,使得其在毒理学中的应用越来越广泛。由于现在建立的鱼类细胞系的种类和数量繁多,而每种细胞系对毒物的反应又存在较大差异,因此,需要通过检测不同的污染物对不同细胞系的毒性,以确立敏感的、适合的细胞体外模型应用于其毒性早期预警的研究。本文主要研究鱼类细胞体外模型对检测我国水体中常见的四种重金属——镉（Cd）、铬（Cr）、锌（Zn）、铜（Cu）的毒性敏感性和适用性。通过比较不同培养代数、不同物种、不同组织来源的早期传代细胞系和永生性细胞系对重金属的毒性敏感性,确立每种重金属的相对敏感细胞系,然后以毒性敏感细胞系为体外模型检测重金属的细胞毒性、氧化损伤和基因毒性,探讨敏感的、适用的鱼类细胞体外模型在重金属毒性检测中的应用前景,主要研究结果如下:1、三株鱼类细胞系的建立利用组织块贴壁法新建了胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticu）肌肉细胞系CSM与吻端组织细胞系CSSN以及稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）鳍条细胞系RMF三株细胞系,并通过细胞计数研究其最适生长条件和冻存复苏能力,通过染色体分析和线粒体基因分析鉴定其遗传种质。结果表明新建的三株细胞系均为成纤维贴壁型细胞,形态较均一;三株细胞系均能在含10%FBS的L-15培养液及25℃的培养条件下具有连续传代能力,其中CSM的最适培养液为M199;冻存的5th、10th、15th细胞的复苏能力较强,其复苏后存活率均在90%以上,贴壁率在50%-80%之间;染色体分析表明新建细胞系虽然存在染色体缺失与增多现象,但仍为正常四倍体细胞（染色体条数100,CSM和CSSN细胞系）和二倍体细胞（染色体条数为50,RMF细胞系）;线粒体基因（12s rRNMl8s rRNA、cytb）分析表明PCR扩增的基因片段序列与其来源鱼类的发表序列完全一致。可见,新建的三株鱼类细胞系具有体外连续传代能力且未发生遗传突变,可作为早期培养细胞模型应用于水环境污染物的毒性检测。2、十二株鱼类细胞系对检测重金属毒性的敏感性研究（1）首先,利用MTT法（以IC50值为指标）和细胞总蛋白含量测定法（CB法）（以IC50值为指标）检测氯化镉（CdCl2·2.5H2O）、重铬酸钾（K2Cr2O7）、氯化锌（ZnCl2）、硫酸铜（CuSO4·5H2O）对草鱼CIK细胞的细胞毒性,利用彗星实验法（SCGE法）（以DNA损伤率为指标）以及PI染色流式细胞仪法（FCM法）（以细胞凋亡率为指标）检测镉、铬（Ⅵ）、锌、铜对草鱼CIK细胞的基因毒性。结果表明四种体外检测方法均能通过不同的指标定性比较重金属对草鱼CIK细胞的毒性大小,其检测出重金属的毒性大小均为Cd＞Cr＞Cu＞Zn;两种重金属细胞毒性检测方法——MTT法和CB法得到的四种重金属的IC50值无显著性差异;综合比较这四种方法的优缺点,确定了MTT法为简单、快速、重复性好的重金属毒性敏感细胞系体外检测方法。（2）其次,利用MTT法,以IC50值为指标,比较了三株不同物种、不同组织来源、不同培养代数的新建细胞系,以及来源于不同组织、不同物种的九株永生性鱼类细胞系对重金属毒性的敏感性。结果表明随着培养代数的增加,三株新建细胞系对重金属的毒性敏感性有所下降,但在20代之内未见显著性差异;同一物种不同组织来源的鱼类细胞系对重金属的毒性敏感性是不同的;同一组织来源的不同物种的鱼类细胞系对重金属的毒性敏感性也是不同的,且早期传代细胞系不一定比永生性细胞系对重金属的毒性更敏感;确定了氯化镉的毒性敏感细胞系为斑点叉尾鮰卵巢细胞系CCO,重铬酸钾和氯化锌的毒性敏感细胞系均为鲤上皮瘤细胞系EPC,硫酸铜的毒性敏感细胞系为草鱼肾脏组织细胞系CIK。3、毒性敏感细胞系在重金属毒性检测中的应用以上述研究确定的毒性敏感细胞系作为体外模型,通过细胞形态观察,MTT法和CB法检测重金属的细胞毒性,采用脂质过氧化水平、GPX和SOD酶活性的测定检测重金属造成的氧化损伤,利用彗星实验法检测DNA的损伤,使用流式细胞法检测细胞凋亡和细胞周期的变化。结果表明重金属能引起细胞发生变圆、崩解、脱落,并抑制细胞生长,显著降低细胞存活率,引起细胞脂质过氧化物水平增加,造成细胞GPX和SOD酶活性下降,总抗氧化能力减弱,导致细胞发生氧化损伤;使细胞DNA单链发生断裂,发生DNA损伤;并引起细胞凋亡和细胞周期时相改变,且这些作用均呈浓度依赖关系。可见,确定重金属毒性敏感细胞系进行其毒性早期预警是可行的,并且可以较为准确地预测重金属的毒性作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 鱼类细胞培养的现状及应用
• 1.1 鱼类细胞培养的现状
• 1.2 鱼类细胞培养的应用
• 2 鱼类细胞培养在毒理学上的应用
• 2.1 体外检测系统的提出与发展
• 2.2 在检测细胞毒性上的应用现状
• 2.3 在检测基因毒性上的方法改进
• 2.4 在毒性检测应用中的优缺点
• 3 重金属对鱼类的毒性研究进展
• 3.1 氯化镉对鱼类的毒性研究
• 3.2 重铬酸钾对鱼类的毒性研究
• 3.3 氯化锌对鱼类的毒性研究
• 3.4 硫酸铜对鱼类的毒性研究
• 第二章 三株鱼类细胞系的建立及鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 组织块贴壁法进行细胞的原代培养
• 2.2 细胞的传代培养
• 2.3 细胞的冻存与复苏
• 2.4 最适生长条件选择
• 2.5 细胞的染色体分析
• 2.6 细胞的核糖体rRNA和细胞色素b的基因分析
• 2.7 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 细胞生长动态
• 3.2 细胞的冻存和复苏能力
• 3.3 最适生长条件的选择
• 3.4 染色体核型分析
• 3.5 线粒体基因分析
• 4 讨论
• 第三章 十二株鱼类细胞系对检测重金属毒性的敏感性研究
• 第一节 四种毒性检测方法（MTT、CB、SCGE、FCM）的比较
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 MTT法测定重金属的细胞毒性
• 2.2 细胞总蛋白含量（CB法）测定细胞毒性
• 2.3 彗星实验（SCGE法）检测细胞单链DNA损伤
• 2.4 流式细胞法（FCM法）检测细胞凋亡
• 2.5 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 MTT法最佳实验条件的选择
• 3.2 MTT法测定不同重金属的细胞毒性
• 3.3 细胞总蛋白含量（CB法）测定不同重金属的细胞毒性
• 3.4 彗星实验（SCGE法）测定不同重金属对细胞的DNA损伤
• 3.5 流式细胞仪（FCM法）测定不同重金属对细胞造成的凋亡
• 4 讨论
• 第二节 十二株细胞系对重金属的毒性敏感性的研究（MTT法）
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 MTT检测
• 2.3 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 氯化镉对十二株细胞系的毒性比较
• 3.2 重铬酸钾对十二株细胞系的毒性比较
• 3.3 氯化锌对十二株细胞系的毒性比较
• 3.4 硫酸铜对十二株细胞系的毒性比较
• 4 讨论
• 第四章 毒性敏感细胞系在重金属毒性检测中的应用
• 第一节 氯化镉对CCO细胞的毒性
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养方法
• 2.2 细胞形态观察
• 2.3 细胞毒性分析
• 2.4 MDA、SOD、GPX和T-AOC测定
• 2.5 彗星实验检测细胞DNA损伤
• 2.6 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期
• 2.7 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 氯化镉对CCO细胞形态的影响
• 3.2 氯化镉对CCO细胞存活率的影响
• 3.3 氯化镉对CCO细胞的氧化损伤
• 3.4 氯化镉对CCO细胞的DNA损伤
• 3.5 氯化镉对CCO细胞凋亡的影响
• 3.6 氯化镉对CCO细胞周期时相分布的影响
• 4 讨论
• 第二节 铬（Ⅵ）对EPC细胞的毒性
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养方法
• 2.2 细胞形态观察
• 2.3 细胞毒性分析
• 2.4 MDA、SOD、GPX和T-AOC测定
• 2.5 彗星实验检测细胞DNA损伤
• 2.6 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期
• 2.7 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 重铬酸钾对EPC细胞形态的影响
• 3.2 重铬酸钾对EPC细胞存活率的影响
• 3.3 重铬酸钾对EPC细胞的氧化损伤
• 3.4 重铬酸钾对EPC细胞的DNA损伤
• 3.5 重铬酸钾对EPC细胞凋亡的影响
• 3.6 重铬酸钾对EPC细胞周期时相分布的影响
• 4 讨论
• 第三节 锌对EPC细胞的毒性
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养方法
• 2.2 细胞形态观察
• 2.3 细胞毒性分析
• 2.4 MDA、SOD、GPX和T-AOC测定
• 2.5 彗星实验检测细胞DNA损伤
• 2.6 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期
• 2.7 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 氯化锌对EPC细胞形态的影响
• 3.2 氯化锌对EPC细胞存活率的影响
• 3.3 氯化锌对EPC细胞的氧化损伤
• 3.4 氯化锌对EPC细胞的DNA损伤
• 3.5 氯化锌对EPC细胞凋亡的影响
• 3.6 氯化锌对EPC细胞周期时相分布的影响
• 4 讨论
• 第四节 铜对CIK细胞的毒性
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养方法
• 2.2 细胞形态观察
• 2.3 细胞毒性分析
• 2.4 MDA、SOD、GPX和T-AOC测定
• 2.5 彗星实验检测细胞DNA损伤
• 2.6 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期
• 2.7 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 硫酸铜对CIK细胞形态的影响
• 3.2 硫酸铜的CIK细胞存活率的影响
• 3.3 硫酸铜对CIK细胞的氧化损伤
• 3.4 硫酸铜对CIK细胞的DNA损伤
• 3.5 硫酸铜对CIK细胞凋亡的影响
• 3.6 硫酸铜对CIK细胞周期时相分布的影响
• 4.讨论
• 全文总结
• 1 本论文主要研究结果
• 1.1 新建细胞模型的研究
• 1.2 体外检测方法的研究
• 1.3 重金属毒性敏感细胞系的研究
• 1.4 重金属对细胞的毒性作用研究
• 2 本论文的创新之处
• 2.1 模型创新
• 2.2 方法创新
• 2.3 应用创新
• 参考文献
• 附录
• 致谢