拟南芥甘油二酯激酶（AtDGK7）基因抗逆生理功能研究

论文摘要

甘油二酯激酶（diacylglycerol Kinase, DGK）是生物体内磷脂酸（phosphatidic acid, PA）合成途经中的关键酶。PA是生物膜上分子量最小的磷脂,也是合成膜脂和脂库的一个媒介,在膜的代谢和生物合成过程中起重要作用。同时,PA作为动植物体内的一个脂质调节因子,参与调控多种细胞生物学过程。关于PA的调控作用,动物中研究比较深入,植物中报道较少。但近几年研究发现PA同样调控植物的生长、分化、繁殖、激素响应,以及多种生物和非生物胁迫的信号转导过程。病原体、干旱、高盐、冷害等多种胁迫均可诱导植物体内PA水平的升高。生物体内源PA主要通过2条途径合成,目前对PLD途径报道较多,而对PLC-DGK途径的研究较少,植物中关于DGK的研究相对欠缺。本实验室通过构建正义表达载体,转化拟南芥获得过表达AtDGK7转基因植株,分别从基因组水平和转录水平鉴定转基因后代,对T3代阳性转基因植株进行抗性试验、胁迫相关基因的半定量RT-PCR分析,以及逆境相关生理指标的测定。主要研究结果如下:1.构建了pBI121-AtDGK7正义表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥。分别从基因组和转录水平鉴定转基因植株,基因组PCR结果显示,9个拟南芥转基因植株为阳性,挑选其中5个阳性植株进行RT-PCR分析,发现AtDGK7基因在TG1、TG2、TG4株系中表达相对较高,TG3、TG5表达相对较低。故选取TG2、TG4、TG5后代进行后续生理分析。2.不同处理下萌发率及萌发后生长状况比较发现,过表达AtDGK7转基因拟南芥对ABA不敏感,1μmol/L外源ABA处理条件下,转基因拟南芥萌发率明显较野生型高。200mmol/L NaCl处理条件下,转基因拟南芥长势明显优于野生型拟南芥,过表达AtDGK7转基因拟南芥抗盐能力显著提高。3.植物遭受盐胁迫和水分胁迫时,胁迫相关基因P5CS1、P5CS2被诱导表达,该类基因在转基因植株中表达量明显较野生型拟南芥高。而RD29A的表达量在野生型拟南芥和转基因拟南芥差异不显著。推测在植物对逆境胁迫信号的传导中,转基因植株主要是通过P5CS1,P5CS2等基因介导的通路提高植物的抗逆性,而RD29A可能不参与该信号通路。此外,ABI2和HAB1在转基因植株中表达量较野生型植株略低。推测,AtDGK7的转入可能在某种程度上削弱了ABI2和HAB1的表达,进而抑制ABI1的蛋白磷酸酶活性。4.在4℃低温处理条件下,转基因拟南芥脯氨酸含量明显高于野生型拟南芥。叶片SOD活性均有增高,但三个转基因拟南芥株系SOD活性高于野生型植株,且差异显著。MDA含量在低温处理后呈上升趋势,但转基因拟南芥MDA含量较野生型拟南芥低,说明转基因拟南芥膜脂过氧化程度低于野生型拟南芥,膜伤害程度较轻。5.多次试验发现,在温度、光强、光周期及水分状况相同的条件下,过表达AtDGK7转基因拟南芥开花时间明显早于野生型拟南芥。

论文目录

• 英文缩写符号及中英文对照表
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 DGK 的信号转导作用
• 1.1.1 DGK 家族
• 1.1.2 PLD 家族
• 1.1.3 PLD 和DGK 产生不同的PA
• 1.1.4 DGK 活性
• 1.1.5 PLC-DGK 与PLD 途径的交互作用及特异性
• 1.2 植物中DGK 的分子和生理学效应
• 1.2.1 伤胁迫后的AtDGK2
• 1.2.2 冷害和冻害条件下的DGK
• 1.2.3 外界激发子激活PLC-DGK 途径
• 1.2.4 cf-4/Avr4 病毒引起的分子效应
• 1.2.5 结瘤因子引起的分子效应
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料与处理
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 提取RNA 的材料收集
• 2.2.2 提取拟南芥总RNA
• 2.2.3 提取总RNA 后，去除基因组DNA
• 2.2.4 电泳检测RNA 是否降解步骤
• 2.2.5 RNA 反转录
• 2.2.6 拟南芥AtDGK7 基因的克隆及测序
• 2.2.6.1 PCR 扩增
• 2.2.6.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6.3 连接
• 2.2.6.4 转化及克隆筛选
• 2.2.6.5 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.6.6 酶切鉴定
• 2.2.7 表达载体的构建
• 2.2.7.1 碱法大量提取质粒DNA
• 2.2.7.2 载体构建
• 2.2.8 根癌农杆菌LBA4404 和GV3101 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.8.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.8.2 冻融法转化农杆菌
• 2.2.8.3 利用农杆菌介导转化拟南芥
• 2.2.9 转基因拟南芥植株的PCR 检测
• 2.2.9.1 SDS 小量法提取基因组
• 2.2.9.2 转基因拟南芥的种植培养
• 2.2.9.3 转基因植株的PCR 筛选
• 2.2.10 转基因拟南芥半定量RT-PCR 检测
• 2.2.11 半定量 RT-PCR 检测拟南芥中 P5CS1、P5CS2 和 RD29A 的表达
• 2.2.12 萌发试验
• 2.2.13 转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同培养基上的根的伸长
• 2.2.14 生理指标的测定
• 2.2.14.1 脯氨酸含量的测定
• 2.2.14.2 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2.2.14.3 SOD 活性的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 表达载体 pBI121 的构建
• 3.1.1 扩增AtDGK7 基因
• 3.1.2 克隆到pMD18-T 载体及酶切鉴定
• 3.1.3 构建植物表达载体 pBI121 及酶切鉴定
• 3.2 转基因植株的筛选及鉴定
• 3.2.1 硫酸卡那霉素抗性初筛
• 3.2.2 转基因拟南芥基因组水平鉴定
• 3.2.3 转基因拟南芥转录水平鉴定
• 3.3 转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同处理下萌发率与生长情况统计
• 3.3.1 转基因拟南芥与野生型拟南芥根系生长情况的比较
• 3.3.2 转基因拟南芥与野生型拟南芥在ABA 培养基上的萌发率
• 3.3.3 盐胁迫处理条件下转基因拟南芥与野生型拟南芥生长情况比较
• 3.4 逆境胁迫相关基因表达模式的比较
• 3.4.1 胁迫相关基因的表达分析
• 3.4.2 水分胁迫相关基因的表达分析
• 3.4.3 ABA 相关基因的表达分析
• 3.5 转基因植株与野生型植株对低温胁迫的响应
• 3.5.1 低温条件下拟南芥生长情况比较
• 3.5.2 脯氨酸含量的变化
• 3.5.3 丙二醛含量和SOD 活性的变化
• 3.6 过表达 AtDGK7 转基因拟南芥的早花现象
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间完成的论文