新城疫病毒CH2000株全基因组的序列测定及其对鹅的致病力试验

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一种禽类急性、高度接触性、致死性传染病。该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成严重威胁,因此被世界动物卫生组织定为须通报的疫病（2005年之前为A类疫病）,我国农业部将其列为一类疫病。新城疫病毒在分类地位上属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）、禽腮腺炎病毒属（Avbulavirus）的成员之一,为单股不分节段的负链RNA病毒。整个基因组长度约为15kb,包含6个功能基因:3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,分别编码6个主要蛋白质（NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白）。本研究选取4株本实验室分离保存的新城疫病毒,编号分别为CH2000、06-74、06-87和07-12,对其生物学特性和遗传特性进行了初步研究。采用OIE推荐的办法对其鸡胚平均致死时间测定（MDT）和一日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI）进行了测定,结果四株分离株的ICPI分别为1.83、1.92、1.86、1.86,MDT为60h、67.2h、62.4h、52.8h,表明四株分离株均属于强毒株。采用RT-PCR对4株分离株F基因的主要功能区片段进行了扩增、克隆和序列分析。结果表明4株分离株F蛋白裂解位点的组成为112R-R-Q-K-R-F117,具有新城疫典型强毒株的分子特征,与其致病指数测定结果一致。遗传进化分析表明4株分离株在分类地位上均属于基因Ⅶ亚型,与近年来我国主要流行的基因型一致。参考GenBank中发表的相关全基因组参考序列,设计了9对特异性引物,采用RT-PCR方法对分离株CH2000全基因组进行扩增、克隆和序列测定,使用DNASTAR SeqMan进行全基因组序列拼接,通过绘制各基因的系统发育进化树来分析该毒株遗传变异情况,结果表明该分离株全基因组长度为15192nt,基因组长度符合“六碱基法则”。其全基因组核苷酸的同源性及分子进化关系与Goose paramyxovirus SF02、ZJ1两株毒株亲缘关系相对更近,由此推测此分离株可能与Goose paramyxovirus SF02、ZJ1两株病毒有着共同的祖先。选取CH2000和经典参考株F48E8,对15日龄的非免疫五龙鹅进行了人工感染试验。结果表明在攻毒剂量为105ELD50/1ml条件下,CH2000肌注组的发病率和死亡率均为100%,口服、滴鼻组的发病率和死亡率均为93%;参考株F48E8肌注组的发病率和死亡率均为100%、60%,口服、滴鼻组的发病率和死亡率分别为100%、53%。人工感染鹅的潜伏期为50-80小时,大部分在4-5天死亡。发病鹅表现明显的临床症状和病理变化。本研究通过对4株近年来新城疫病毒分离株进行系统的生物学特性研究,证实4株病毒均属于强毒株,在分类地位上属于基因Ⅶ型,与我国目前流行的主要基因型一致。通过对2000年分离到的CH2000进行全基因组序列测定,为进行新城疫病毒的遗传与衍化的研究提供了实验数据并进一步为NDV的反向遗传学技术奠定基础。通过模拟在自然状态下新城疫病毒对水禽的感染和致病性,为证明新城疫病毒在自然情况下的可感染水禽对其致病提供实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 1. 新城疫基本生物学特性
• 2. 新城疫的分子生物学
• 2.1.N DV 各基因的结构与功能如下
• 2.2 各基因对毒力的影响
• 3. 新城疫流行病学概况
• 3.1 世界流行新城疫概况
• 3.2 国内流行的ND 的基因分型状况
• 4. 流行病学特性及水禽的发病规律
• 4.1 宿主范围
• 4.2.N D 流行形式改变的原因分析
• 4.2.1 野毒的严重污染
• 4.2.2 鸡群免疫中存在的问题
• 4.2.3 其它疾病的干扰或免疫失败
• 4.2.4 我国禽类饲养方式的结果
• 4.2.5 流行毒株与疫苗株的同源性差异
• 4.3 新城疫由陆禽到水禽的转变和流行状况
• 4.3.1.N DV 感染宿主的演变
• 4.3.2 演变规律
• 4.3.3 水禽在新城疫传播中的作用
• 4.3.4 我国鹅源新城疫的流行和研究现状
• 5. 立项背景
• 研究一、4 株NDV 分离株生物学特性研究
• 1 材料
• 1.1 病毒、血清及鸡胚
• 1.2 主要分子生物学试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 病毒的复壮与纯化
• 2.1.1 病毒的分离与增殖
• 2.1.2 病毒纯化
• 2.2 血凝试验（HA）及血凝抑制试验（HI）
• 2.2.1 1%鸡红细胞悬液的制备
• 2.2.2 血凝试验（HA）
• 2.2.3 血凝抑制试验（HI）
• 2.3 鸡胚的MDT 的的测定
• 2.4.E LD50 的测定（同时进行F48E8 的ELD50 的测定）
• 2.5. 1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定
• 2.6. NDVF 基因的扩增
• 2.6.1 引物设计与合成
• 2.6.2 病毒 RNA 的提取
• 2.6.3 一步法RT-PCR
• 2.6.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.7.N DV F 基因的克隆
• 2.7.1 感受态细胞的制备（TSS 法）
• 2.7.2.P CR 产物的回收
• 2.8 阳性重组子的筛选与鉴定
• 2.8.1 碱裂解法提取质粒DNA
• 2.8.2 质粒PCR 鉴定
• 2.9.F 基因核苷酸序列测定
• 2.10 序列分析、核苷酸同源性比较、基因分型及进化树的绘制
• 3 结果与分析
• 3.1.N DV 生物学特性鉴定结果
• 3.1.1 病毒分离和鉴定
• 3.1.2 血凝及血凝抑制试验
• 3.1.3 NDV 的毒性试验
• 3.2.F 基因部分扩增序列电泳图
• 3.2.1.F 基因部分序列电泳图
• 3.3.F 基因部分序列的测序结果分析
• 3.3.1 试验毒株与其他禽副粘病毒的F 基因部分序列比对情况
• 3.3.2 试验毒株与其他禽副粘病毒的F 基因部分序列推导氨基酸序列比对情况
• 3.3.3 F 基因部分序列及其推导的氨基酸的同源性比较
• 3.4.F 基因系统进化树
• 研究二、新城疫毒株CH2000 全基因组序列测定
• 1. 材料
• 1.1 病毒 SPF 胚、试剂
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 病毒RNA 的提取
• 2.3 一步法RT-PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 CH2000 全基因组各片段的RT-PCR 扩增电泳图
• 3.2.C H2000 的全基因组测序分析
• 3.2.1.C H2000 与其他禽副粘病毒各个功能基因核苷酸以及氨基酸的同源性比较
• 3.2.2 CH2000 与其他NDV 毒株的NP 非编码区基因比对情况
• 3.2.3 L、HN 基因建立的进化树
• 3.2.4 CH2000 的3′引导序列和5′尾端序列与其他几个禽副粘病毒的比对情况
• 3.2.5.C H2000 与其他禽副粘病毒基因的分子特征和推导的氨基酸长度
• 3.2.6 新城疫毒株各基因型的分子特征和推导产物长度
• 研究三、CH2000 毒株对鹅的致病性试验
• 1、材料
• 1.1 试验毒株
• 1.2 试验鸡胚和鹅
• 2、方法
• 2.1 病毒增殖
• 2.2 鸡源分离株人工感染鹅的试验
• 3 结果与分析
• 3.1 CH2000 和F48E8 对鹅的致病性
• 3.2 主要病变照片
• 参考文献
• 致谢