卵黄蛋白原的纯化与检测及其在己烯雌酚和炔雌醇联合毒性研究中的应用

论文摘要

卵黄蛋白原（Vitellogenin,Vtg）是卵生动物中卵黄蛋白的前体,通常只存在于性成熟的雌性个体中。但是如果雄性或幼体暴露于环境雌激素环境,其体内也能产生Vtg。因此,Vtg被认为是一种理想的环境雌激素蛋白质生物标志物,在研究各种化合物的雌激素效应中被广泛应用。Vtg的纯化多采用离子交换与凝胶渗透两步骤法,耗时长,回收率低、Vtg容易降解。因此,有必要开发一种简单、快速、回收率高的Vtg纯化方法。目前Vtg的检测主要采用特异性的免疫分析方法,方法灵敏,选择性强;但耗时长,操作繁琐。建立快速、简便、可靠的Vtg检测方法成为深入开展Vtg作为环境雌激素标志物研究的关键前提。在环境雌激素毒性研究方面,大多数研究仅针对单一环境雌激素的毒性效应展开,而对多种雌激素的复合污染和联合效应的研究较少。随着我国沿海地区经济的不断发展,大量污染物被排入大海,沿海及河口地区的污染日益加剧,开展持久性强、毒性大的环境雌激素对近海海洋生物联合效应的研究,因而具有重要意义。本研究将离子交换色谱和超滤离心技术相结合,建立了两级纯化Vtg的新方法;将内源荧光法与紫外分光法相结合,建立了灵敏度高、线性范围广、操作简单的Vtg测定新方法;并在建立分离检测手段的基础上,利用Vtg为主要观察指标,开展己烯雌酚（DES）和炔雌醇（EE2）联合作用研究。本研究的主要内容和结果包括以下几个方面:1.卵黄蛋白原的两级纯化与初步鉴定采用17β-雌二醇（E2）腹腔注射的方式诱导真鲷（Pagrosomus major）产生大量Vtg,利用弱阴离子交换和超滤两级纯化的方法,快速、可靠地获得了纯度和浓度较高、盐度较低的Vtg实验室标样。整个纯化过程省时简便。两级纯化得到的Vtg的色谱、电泳行为及分子量与文献报道的基本一致。2.内源荧光法与紫外分光法串联测定鱼血清中的Vtg利用Mini Q高分辨离子交换色谱柱对鱼血清样品进行分离,采用紫外分光法和内源荧光法同时测定Vtg,建立了一种线性范围宽、灵敏度高、操作简单的测定方法。紫外分光法测定Vtg的线性范围为24.1-96.4μg/mL,检出限为8μg/mL（S/N=5）;荧光法测定Vtg的线性范围为1.9-30μg/mL,检出限为1μg/mL（S/N=5）。分别对鱼血清样品进行5次平行测定,紫外分光法与内源荧光法检测的相对标准偏差（RSD）分别为2.4%（n=5）及3.4%（n=5）。该方法操作简单、快速、重现性好。将本方法应用于美国红鱼（Sciaenops ocellatus）血清中Vtg的测定,结果发现美国红鱼血清中Vtg的离子交换色谱行为与真鲷鱼血清Vtg的相似,说明本方法通用性较强。3.Vtg作为环境雌激素生物标志物的研究以Vtg作为生物标志物,研究了DES、EE2及两者的混合物对美国红鱼幼鱼的浓度-效应及时间-效应关系,并以Vtg为主要指标考察了DES和EE2对美国红鱼的联合雌激素效应。结果如下:（1）DES和EE2对美国红鱼幼鱼具有一定的毒性作用,可使个体异常,严重者死亡。（2）DES、EE2及两者的混合物均使美国红鱼肥满度降低、肝胰脏指数与肾脏指数增加。雌激素浓度增加及暴露时间延长,均使这种影响的结果加重。浓度梯度实验中,DES、EE2及两者的混合物对肝脏指数的影响最明显,对肥满度的影响最小;时间序列实验中,雌激素对肥满度的影响在第30 d显著性出现,对肾脏指数的影响在第18 d显著性出现,而对肝胰脏指数的影响则在第9 d就显著性出现。（3）DES、EE2及两者的混合物在较低浓度（三者浓度分别小于320、160和120ng/L）时,随浓度的增加美国红鱼血清总蛋白浓度及Vtg浓度增加。但随着雌激素浓度的进一步提高,血清总蛋白及Vtg的浓度逐渐降低,出现典型的Hormesis现象。随着暴露时间的增加,血清总蛋白及Vtg的浓度逐渐增加,体现了很好的时间-效应关系。与各项生理指标及血清总蛋白浓度相比,Vtg浓度的变化最显著、最迅速,最能体现DES和EE2的雌激素效应,说明Vtg是一种较好的环境雌激素生物标志物。（4）在Vtg浓度与各指标之间的关系中,Vtg与肥满度没有相关性,而Vtg浓度与血清总蛋白有很好的正相关性（P＜0.001）。Vtg浓度与肝胰脏指数和肾脏指数的相关性有一定的相似性:即Vtg浓度与二者之间有一定的相关性（P＜0.05）;当Vtg浓度较低时,这种相关性更加明显（P值小于或接近0.01）;而当Vtg浓度高时,与两者的相关性降低（P＞0.05）。（5）DES和EE2对美国红鱼幼鱼的剂量-效应关系符合典型的S形剂量-效应关系,用Logistic模型能很好地拟合。采用浓度相加模式和独立作用模式,可预测DES与EE2的联合效应。与独立作用模式相对比,浓度相加模式能更好地预测DES与EE2的联合雌激素效应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（Abbreviations）
• 第一章 前言
• 1.1 环境雌激素概述
• 1.1.1 环境雌激素的种类和来源
• 1.1.1.1 天然雌激素
• 1.1.1.2 人工合成雌激素
• 1.1.1.3 环境化学污染物
• 1.1.1.4 重金属类
• 1.1.2 环境雌激素的危害
• 1.1.2.1 环境雌激素对脊椎动物的危害
• 1.1.2.2 环境雌激素对无脊椎动物的危害
• 1.1.3 环境雌激素的筛选方法
• 1.1.3.1 在体生物测试
• 1.1.3.2 离体生物测试
• 1.2 卵黄蛋白原研究概述
• 1.2.1 卵黄蛋白原的生物特性
• 1.2.2 卵黄蛋白原的分离纯化
• 1.2.2.1 超级离心法
• 1.2.2.2 超滤法
• 1.2.2.3 沉淀法
• 1.2.2.4 液相色谱法
• 1.2.3 卵黄蛋白原的分析方法
• 1.2.3.1 特异性分析方法
• 1.2.3.2 非特异性分析方法
• 1.3 环境雌激素的联合毒性作用研究概述
• 1.3.1 环境雌激素联合效应的试验方法
• 1.3.2 联合作用的评价方法
• 1.3.2.1 联合作用的预测结果与实验结果比较法
• 1.3.2.2 混合物的联合效应与单个最有效成分效应比较法
• 1.3.2.3 等效线法
• 1.3.2.4 比值法
• 1.3.3 雌激素的联合效应
• 1.3.3.1 环境雌激素物质之间的联合效应
• 1.3.3.2 外源性雌激素与内源性雌激素的联合效应
• 1.3.3.3 环境雌激素与非雌激素物质的联合效应
• 1.4 本课题的提出及研究内容
• 1.4.1 立题背景
• 1.4.2 研究目的
• 1.4.3 研究内容与技术路线
• 第一章参考文献
• 第二章 卵黄蛋白原的两级纯化与初步鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器和试剂
• 2.2.2 实验动物
• 2.2.3 卵黄蛋白原的诱导
• 2.2.4 卵黄蛋白原的分离纯化
• 2.2.4.1 卵黄蛋白原的初步纯化—弱阴离子交换色谱法
• 2.2.4.2 卵黄蛋白原粗组分的再纯化—超滤纯化浓缩
• 2.2.5 二级纯化效果的验证
• 2.2.5.1 高分辨强阴离子交换高效液相色谱分析
• 2.2.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 血清蛋白的分离纯化
• 2.3.1.1 血清蛋白的初级纯化—弱阴离子交换色谱分离
• 2.3.1.2 血清蛋白的第二级纯化浓缩—超滤法
• 2.3.2 血清蛋白的电泳分析
• 2.3.2.1 Native-PAGE电泳分析
• 2.3.2.2 SDS-PAGE电泳分析
• 2.4 本章小结
• 第二章参考文献
• 第三章 内源荧光法与紫外分光法串联测定鱼血清中的Vtg
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器和试剂
• 3.2.2 实验动物
• 3.2.3 卵黄蛋白原的诱导
• 3.2.4 卵黄蛋白原实验室标样的获得
• 3.2.5 卵黄蛋白原紫外光谱的测定
• 3.2.6 卵黄蛋白原荧光光谱的测定
• 3.2.7 强阴离子交换高效液相色谱分析参数
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 卵黄蛋白原的紫外光谱
• 3.3.2 卵黄蛋白原的荧光光谱
• 3.3.3 卵黄蛋白原的色谱分离
• 3.3.4 方法的线性范围、检出限和重现性
• 3.3.5 方法的应用
• 3.4 本章小结
• 第三章参考文献
• 2对美国红鱼联合毒性研究中的应用'>第四章 Vtg作为生物标志物在DES和EE₂对美国红鱼联合毒性研究中的应用
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器和试剂
• 4.2.2 实验动物
• 4.2.3 染毒实验
• 4.2.3.1 浓度梯度组
• 4.2.3.2 时间序列组
• 4.2.4 样品预处理
• 4.2.5 血清中卵黄蛋白原的测定
• 4.2.6 强阴离子交换高校液相色谱分析参数
• 4.2.7 血清蛋白总量的测定
• 4.2.8 生理学指标的计算
• 4.2.9 数据处理
• 4.2.10 剂量—效应关系的拟合
• 4.2.11 联合效应的预测方法
• 4.3 结果与讨论
• 2对美国红鱼死亡率的影响'>4.3.1 DES和EE₂对美国红鱼死亡率的影响
• 2对美国红鱼肥满度的影响'>4.3.2 DES和EE₂对美国红鱼肥满度的影响
• 2对肝胰脏指数的影响'>4.3.3 DES和EE₂对肝胰脏指数的影响
• 2对肾脏指数的影响'>4.3.4 DES和EE₂对肾脏指数的影响
• 2对血清总蛋白的影响'>4.3.5 DES和EE₂对血清总蛋白的影响
• 2对Vtg含量的影响'>4.3.6 DES和EE₂对Vtg含量的影响
• 4.3.7 Vtg与各主要指标的关系
• 2的联合效应'>4.3.8 DES和EE₂的联合效应
• 4.3.8.1 浓度—效应关系
• 4.3.8.2 联合效应
• 4.4 本章小结
• 第四章参考文献
• 第五章 结语和展望
• 5.1 本研究的贡献
• 5.2 本研究的不足之处
• 5.3 研究展望
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢