HIV-1Tat 蛋白对DNA-PKcs的影响

论文摘要

艾滋病（AIDS）病毒感染者从早期的HIV感染到艾滋病发病的过程中会发生一些列的病理改变和出现相应的临床表现,其中HIV编码蛋白与机体功能蛋白的相互作用在包括免疫缺陷、恶性肿瘤在内的疾病发生发展中起到非常重要的作用。卡波氏肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、侵袭性宫颈癌被认为是与AIDS密切相关的癌症。AIDS中肿瘤的发生一般被认为是由于缺失免疫系统的监视功能和感染致瘤病毒引起的。然而,越来越多的证据证明HIV-1病毒感染过程中和HIV-1所编码的蛋白在肿瘤发生中发挥着重要的作用。有研究显示HIV-1 Tat蛋白由于其广泛的功能,在肿瘤的诱发中发挥着重要的作用。Tat蛋白是HIV感染早期所合成的小分子调节蛋白,能促进HIV基因表达,增加HIV病毒的复制和感染性。此外,在HIV感染过程中,Tat蛋白能分泌到细胞外,作用于未受HIV感染的CD4+细胞和单核-巨噬细胞,使其更易受HIV的感染。因此Tat作为一个胞外蛋白和细胞基因表达的激活因子在AIDS发生及相关病变过程中起重要作用。肿瘤通常与基因组的不稳定性和DNA修复缺陷紧密相连。DNA的修复机制在维持基因组的稳定中发挥了重要的作用,为肿瘤的发生提供了一道屏障。在多种损伤中,DNA双链断裂（DSB）是真核生物中最严重的损伤。如果双链断裂得不到修复或错误修复,细胞将会死亡,或发生染色质断裂﹑丢失、基因突变,而导致基因组不稳定,增加癌症的风险度。细胞拥有两种DSB的修复途径,即同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。DNA-PKcs在NHEJ中发挥了重要的功能。DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit）,与另外两个亚单位Ku70和Ku80共同构成DNA-PK复合物。DNA-PKcs与ATM、ATR等同属于磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶（PI3K）超家族成员。本研究使用表达纯化的Tat蛋白和转染HIV-1 tat基因的人横纹肌肉瘤细胞系模型,探讨Tat蛋白对细胞损伤修复的影响以及相关机制,获得如下主要结果:（1）成功地在Rosetta-gami B（DE3）菌株中高效表达了HIV-1 Tat蛋白,通过亲和层析法在体外纯化出纯度>95%的蛋白,使用报告质粒KB/SP1LTR检测发现纯化后的蛋白具有生物活性,并能很快的穿梭于细胞中,该蛋白在体内的半衰期大约为4h,为Tat蛋白的体外研究奠定了基础。（2）通过荧光素酶报告基因检测系统,发现Tat蛋白能够抑制DNA-PKcs启动子的活性,Tat蛋白不仅对DNA-PKcs启动子的核心区域有抑制作用,还对启动子的非核心区域的转录活性有抑制作用。通过ESMA的实验我们证实了Tat蛋白并不能直接结合在DNA-PKcs的核心区域,Tat蛋白并不是通过调节某个转录因子而调节DNA-PKcs的启动子序列。通过AO3的染色质重塑模型,我们验证了Tat蛋白能够参与大规模的染色质重塑,IR能抑制Tat蛋白参与的染色质重塑,Tat蛋白可能通过染色质重塑调节DNA-PKcs的转录,通过构建不同的突变体发现Tat蛋白的28、50和51位的赖氨酸在染色质重塑中发挥着重要的功能。（3）发现Tat蛋白提高细胞内DNA-PKcs的磷酸化水平,与相应对照组比较,表达Tat蛋白细胞在IR后的不同时间点DNA-PKcs pS2056的磷酸化水平都有明显的升高。通过DNA-PK激酶检测试剂盒的检测,发现Tat蛋白在体外能够明显的激活DNA-PKcs激酶活性。通过免疫共沉淀、GST-pull down发现Tat在体内外与DNA-PKcs相互作用,通过免疫荧光证明了Tat与DNA-PKcs在胞核内有共定位。通过构建了DNA-PKcs的不同区域,通过免疫共沉淀发现Tat蛋白结合在DNA-PKcs的FAT区域,FAT区域是Ku蛋白与DNA-PKcs的结合域,我们进一步的发现Tat蛋白还能与Ku70、Ku80有相互作用。（4）发现Tat蛋白能够引起细胞内的γ-H2AX foci,通过中性单细胞凝胶电泳检测了Tat蛋白能够引起细胞的DSB。通过荧光显微镜和流式检测发现Tat蛋白能够提高细胞内的ROS水平。然后又检测了MDA和GSH等指标,与对照细胞相比,发现Tat蛋白能够明显的升高了胞内的MDA和降低了胞内的GSH水平。通过Western blotting检测,发现Tat蛋白明显的下调了细胞的Prx1、2、5、6和Cu/ZnSOD蛋白表达。（5）细胞周期检测发现,293T和Tat作用下的293T细胞经4Gyγ射线照射后表现出程度不同的G2/M期阻滞,Tat蛋白作用下的293T细胞G2/M阻滞出现较对照组细胞晚,而在照射后48h时对照细胞G2/M期阻滞已恢复,但Tat蛋白作用下的293T细胞的阻滞仍很显著。表明外源的Tat蛋白能导致细胞周期G2/M期检查点功能异常,致使电离辐射作用后的细胞周期发生改变。（6）通过免疫共沉淀、GST-pull down发现Tat在体内外与Plk1和Chk2有相互作用。在293T和HeLa细胞中共转染了融合表达的RFP-Tat和GFP-Plk1,发现两者在细胞的胞核内有共定位。构建不同的截短体,通过GST-pull down发现Tat蛋白的22-48位的氨基酸结合在Plk1 N-端的激酶结构域。发现Tat蛋白能够提高细胞内Chk2 T68位酪氨酸的磷酸化水平,与相应对照组比较,表达Tat蛋白细胞在IR后的不同时间点Chk2 T68的磷酸化水平都有明显的升高。

论文目录

• 英文缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1. 材料
• 2. 实验方法
• 结果
• 第一节 Tat 蛋白的表达与纯化
• 第二节 Tat 蛋白对DNA-PKcs 表达的调控
• 第三节 Tat 诱发细胞氧化应激反应
• 第四节 Tat 蛋白对细胞周期的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢