通过体外外显子重复构建新的溶菌酶

论文摘要

酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计,是更有效、更接近于自然进化过程的一种蛋白质工程研究新策略,是分子进化的一个重要分支。“外显子改组”是定向进化的重要方法之一,我们的目的是利用该方法对天然酶分子进行人为快速进化。本研究以人溶菌酶为模型,通过体外外显子重复构建新的溶菌酶。人溶菌酶基因含有四个外显子,其中第二外显子负责编码第28-82 位氨基酸残基,包括了催化中心的残基（Glu35 和Asp53）和结合寡糖底物的一簇氨基酸,可能代表原始的糖苷酶,是我们进行“外显子改组”的主要目标。在第二和第三外显子表达产物之间存在一突环,与突环中的74、75 位氨基酸相对应的基因之间恰好存在HincII 限制性内切酶的酶切位点,我们将化学合成的第二外显子插入该位点,构成含有重复第二外显子的溶菌酶基因。将目的基因连接入pPIC9 载体,导入毕赤酵母细胞中,诱导表达产生新的溶菌酶。经过纯化的新溶菌酶的比活力比野生型溶菌酶提高了12.4%。本实验初步验证了体外外显子重复是一种有效的定向进化方法。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 立题依据
• 1.2 溶菌酶简介
• 1.3 实验设计
• 第二章 实验材料
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 其它
• 第三章 实验方法和原理
• 3.1 目的基因的构建
• 3.2 重组质粒的转化
• 3.3 重组子的筛选和鉴定
• 3.4 目的基因在毕赤酵母中的表达
• 3.5 目的蛋白的纯化和活力测定
• 第四章 实验结果
• 4.1 目的基因的构建
• 4.2 重组子的筛选和鉴定
• 4.3 目的基因在毕赤酵母中的表达
• 4.4 目的蛋白的纯化和活力测定
• 第五章 讨论
• 5.1 重组子的筛选和鉴定
• 5.2 影响表达量的因素
• 5.3 目的蛋白活力获得提高的原因
• 第六章 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致 谢
• 导师及作者简介