论文摘要
植物V-ATPase是一类特殊的膜结合转运蛋白，广泛分布于植物的液泡、质膜以及内质网、高尔基体、小泡等内膜系统上。它的主要功能是催化水解ATP，跨细胞内膜系统建立质子电化学梯度，为次级转运提供动力，推动相关离子和小分子代谢产物进行跨膜转运。在植物的生长发育及适应环境的变化中具有重要的作用。尽管目前对于V-ATPase的结构和亚基组成已作了大量研究，编码亚基的基因也已经从许多植物中克隆，但是关于V-ATPase亚基基因在不同逆境下的表达与调控的研究鲜有报道。且在本实验室的前期研究中发现V-ATPase亚基A基因（ZmVHA-A）受干旱胁迫诱导表达。基于此本研究采用RACE技术对玉米V-ATPase A亚基基因（ZmVHA-A）进行了克隆，分析了ZmVHA-A基因在苗期水分胁迫，盐胁迫、冷胁迫、外源ABA和花期水分胁迫下的表达特征；同时对V-ATPase的另一个关键亚基B基因（ZmVHA-B）进行了克隆，并对ZmVHA-B基因在苗期水分胁迫，盐胁迫、冷胁迫、外源ABA和花期水分胁迫下的表达特征也进行了分析；力图通过对其关键亚基基因的分析阐释V-ATPase在逆境下的调节及响应机制。同时构建ZmVHA-A：GFP融合表达载体转化洋葱表皮细胞，对亚基A进行了亚细胞定位的研究。最后把ZmVHA-A基因融合在35S启动子之下构建了过表达载体，并转化拟南芥进行过表达分析。主要研究结果如下：1．利用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）策略，扩增出ZmVHA-A基因的5′端和3′端序列，然后用RT-PCR扩增ZmVHA-A编码框cDNA序列，编码区长1863bp，编码620个氨基酸，推测分子量为69KDa，等电点为5.36。同时通过RT-PCR获得ZmVHA-B基因的编码区序列，序列分析表明：该基因编码487个氨基酸，蛋白分子量为54.09kD,等电点为4.99。2．氨基酸同源性分析和聚类分析表明V-ATPase A和B亚基都是高度保守的蛋白亚基，且不同物种的V-ATPase亚基A和B的同源性高低与生物进化具有高度的相关性。结构预测结果表明A亚基上存在两个保守的功能结构域，B亚基上也同样存在它发挥调节作用所必需的保守功能结构域。3．GFP融合标记法对ZmVHA-A进行定位分析，结果表明：当GFP单独转化洋葱表皮细胞时，GFP蛋白在洋葱表皮细胞膜、细胞质和细胞核中表达：而融合蛋白在洋葱表皮细胞的胞质中表达，表明ZmVHA-A基因主要在细胞胞质中表达，这一结果与前人研究结果一致。4．Northern杂交结果表明玉米ZmVHA-A和ZmVHA-B基因在花期水分胁迫下花丝中被诱导表达，在苗期ZmVHA-A和ZmVHA-B基因也对干旱、高盐、低温胁迫和ABA处理也做出了响应，V-ATPase基因在这些胁迫过程中可能通过参与某些共同的调节通路参与逆境胁迫响应。在苗期ZmVHA-A和ZmVHA-B基因都对（干旱）水分胁迫作出了响应，它们的表达与叶片相对含水量并不成一一对应关系；ZmVHA-A和ZmVHA-B这两个基因都可被外源ABA诱导表达。ZmVHA-B基因在苗期干旱和高盐下的叶子中和花期干旱下的花丝中存在着双转录本的诱导表达，这些同工型的诱导表达可能在逆境条件下发挥着重要功能。