论文摘要
疫苗是预防控制传染病的最有效最经济的手段。DNA疫苗作为最有发展潜力的新型疫苗策略之一,可以有效的诱导细胞免疫反应及体液免疫反应,同时可以诱导长期免疫记忆。然而,较弱的免疫原性一直是制约DNA疫苗产业化的瓶颈。本研究综合运用载体改造、基因修饰及质粒投送手段,大幅度提高了HIV-1 DNA疫苗的免疫原性。本实验室经验表明,疫苗质粒大小超过9Kb会使生产难度大幅度提高,并使质粒进入细胞的效率显著降低。为了构建多价HIV DNA疫苗,本课题从DNA疫苗载体pDRVI1.0出发,通过删除约2Kb质粒骨架非必需序列,构建了pDRVI4.0质粒载体,并以此为基础构建HIV DNA疫苗。动物免疫结果表明,与基于pDRVI1.0的DNA疫苗相比,pDRVI4.0作载体的疫苗所诱导的体液和细胞免疫反应无显著差异。将覆盖HIV-1中国流行株CN54 6个抗原基因的4个遗传密码优化的免疫原基因Env、Pol、Gag和TNR（编码Tat-Nef-Rev融合蛋白）分别克隆入pDRVI4.0载体,得到4个单顺反子DNA疫苗质粒p4.0-Env、p4.0-Pol、p4.0-Gag和p4.0-TNR。为进一步降低疫苗生产和应用成本,从pDRVI4.0载体出发,构建2个双顺反子DNA疫苗质粒p4.0-Env/Pol和p4.0-Gag/TNR。将双顺反子疫苗和单顺反子疫苗平行免疫小鼠,结果表明双顺反子DNA疫苗所诱导的免疫反应与单顺反子DNA疫苗无显著差异。为了进一步提高双顺反子DNA疫苗的免疫原性,本课题对Pol、Gag和TNR抗原基因进行跨膜修饰,得到表达后锚定于细胞表面的抗原基因,并构建了携带这些基因的双顺反子DNA疫苗p4.0-Env/Pol-TM和p4.0-Gag/TNR-TM。小鼠免疫结果表明,抗原跨膜修饰可以从总体上增强DNA疫苗诱导的特异性体液和细胞免疫反应。为了研究表达和排列方向对双顺反子DNA疫苗免疫原性的影响,本课题构建了两个表达盒排列方向相反的双顺反子DNA疫苗质粒p4.0-Env/Pol-TM-trans和p4.0-Gag/TNR-TM-trans。小鼠免疫结果表明,表达盒排列方向对双顺反子DNA疫苗所诱导的体液和细胞免疫反应均无影响。其次,本研究应用体内电穿孔技术增强DNA疫苗的递送效率。我们用本实验室保存的携带荧光素酶Luciferase基因的报告质粒p1.0-Luc和携带HIV-1 CN54 Env基因的DNA疫苗质粒p1.0-Env通过肌肉注射、肌肉注射后加电穿孔两种不同方法注射小鼠,用IVIS?活体成像系统实时检测Luciferase报告基因在体内的表达情况,用ELISA检测HIV-1 Env特异的抗体反应,用IFN-γELISpot检测HIV-1 Env特异的T细胞免疫反应。结果表明体内电穿孔技术可以显著提高Luciferase在小鼠体内的表达水平,增强幅度达35倍。Env特异性的免疫结果显示,8μg质粒剂量电穿孔途径诱导的体液和细胞免疫应答强于40μg质粒剂量单纯肌肉注射组;体内电穿孔途径免疫2次与单纯肌肉注射途径免疫3次诱导的体液和细胞免疫应答水平相当。综合以上两部分的结果,双顺反子DNA疫苗可以在不牺牲疫苗免疫原性的前提下大幅度减少DNA疫苗质粒数量和质粒大小;对抗原基因进行跨膜修饰可以显著增强DNA疫苗诱导的体液和细胞免疫反应;体内电穿孔技术作为一种新的基因投送途径可以显著增强目的基因表达水平及DNA疫苗免疫原性。