共轭亚油酸高产菌株的诱变选育及其在发酵乳上的应用研究

论文摘要

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid,简写CLA）是一种含有18个碳原子的不饱和脂肪酸,研究发现它具有多种生理活性,例如抗癌、减肥、增强免疫力等。它是人体必需脂肪酸—亚油酸（Linoleic Acid,简写LA）的共轭形式,目前工业上主要由化学法合成。虽然转化率很高,但是产物组成复杂,还含有很多反式脂肪酸,限制了其在食品行业的应用;除此,在化学合成过程中涉及高温高压操作,耗能高、污染大、危险系数大,增加了企业的投资成本。研究发现,由微生物转化LA生产CLA具有诸多优点,无污染,反应条件温和,不涉及强酸强碱,对设备要求低,合成产物异构体较单一,利于分离纯化等,逐步被广大科研工作者重视。本文主要从实验室保藏的一株有CLA合成能力的植物乳杆菌入手,对其进行诱变处理,以期提高该菌株的发酵能力,获得高产菌株;研究了影响该菌株发酵能力的因素,并利用响应面分析法优化了发酵工艺;利用该菌株的活细胞作为细胞酶,探索了在超临界状态下CLA的转化试验;最后将该高产菌株应用在富含CLA发酵牛乳的研制上,研究获得了最佳的发酵条件。主要结论如下:1、利用N+注入、亚硝基胍复合诱变法,对原始菌株进行诱变处理,获得了一株高产CLA的突变菌株,命名为L. plantarum M-66。较出发菌株的发酵能力,L. plantarum M-66合成CLA的产量提高了47%,达到197μg/mL。2、在单因素试验的基础上,运用中心组合试验设计原理采用5因素3水平响应面分析方法对影响突变株L. plantarum M-66发酵能力的因素进行了优化,结果为:反应时间30h,反应温度34℃,pH值7.0,接种量3%,底物浓度1.2mg/mL,在此条件下进行验证试验,试验结果CLA平均产量为224.1μg/mL,转化率为18.68%。3、对超临界CO2状态下利用L. plantarum M-66湿细胞转化LA生成CLA的反应体系进行了研究,最适pH值为7,最适温度为37℃,最适底物浓度为1mg/mL,最适细胞酶浓度为25%,最适压力为15MPa,在此条件下CLA的产量为600μg/mL,转化率达到60%。4、开展了该突变株在富含CLA发酵乳上的应用研究,选取商业发酵剂YO-MIX 495（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）和突变株L. plantarum M-66作为试验发酵剂,考察酸度、CLA两个指标,并辅以感官评定打分,确定了最佳的发酵菌种配比为L. plantarum M-66:商业发酵剂=3:1,最佳的发酵温度为37℃,接种量为4%。在这个条件下所得到的酸奶色泽呈乳白色,且凝固性良好,组织均匀,酸味甜味适中,总体感官评价达到了国家标准的要求。利用气相色谱分析法确定了本试验研制的酸奶中CLA含量较没有添加L. Plantarum M-66发酵得到的酸奶中CLA含量为151.2μg/mL,占总脂肪酸含量的4.48%,且c9,t11-CLA与t10,c12-CLA的含量比例为1.3:1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 CLA 的结构和化学性质
• 1.2 CLA 的生理功效
• 1.2.1 CLA 的抗癌作用
• 1.2.2 CLA 维护心血管健康的作用
• 1.2.3 CLA 减少机体多余脂肪的作用
• 1.2.4 CLA 免疫调节的功能
• 1.2.5 CLA 对骨骼健康的影响
• 1.2.6 CLA 影响体内胰岛素水平的作用
• 1.3 CLA 在体内的代谢
• 1.4 CLA 的来源与合成
• 1.4.1 CLA 的来源
• 1.4.2 CLA 的化学合成
• 1.4.3 CLA 的生物合成
• 1.5 CLA 的分析检测
• 1.6 超临界流体的研究
• +注入诱变技术的研究'>1.7 N⁺注入诱变技术的研究
• 1.8 研究目标、研究内容和研究意义
• 1.8.1 研究目标
• 1.8.2 研究内容
• 1.8.3 研究意义
• 第二章 共轭亚油酸高产菌株的诱变选育
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 菌体生长曲线的绘制
• 2.1.6 亚油酸LA 的乳化
• +注入诱变'>2.1.7 N⁺注入诱变
• 2.1.8 亚硝基胍（NTG）诱变
• 2.1.9 随机扩增多态性DNA 分析（RAPD）
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 原始菌株生长曲线
• +注入诱变选育高产菌株'>2.2.2 N⁺注入诱变选育高产菌株
• 2.2.3 NTG 诱变处理高产菌株的筛选
• 2.2.4 RAPD 分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 突变株L. Plantarum M-66 发酵条件的优化研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 菌种的活化
• 3.1.6 不同碳源对菌株生成CLA 的影响
• 3.1.7 不同氮源对菌株生成CLA 的影响
• 3.1.8 发酵参数的研究
• 3.1.9 发酵条件的优化
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 碳源对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.2 氮源对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.3 温度对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.4 初始pH 值对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.5 发酵时间对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.6 底物浓度对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.7 接种量对菌株CLA 产量的影响
• 3.2.8 发酵条件的优化
• 3.2.9 两因素间的交互效应分析
• 3.3 本章小结
• 2条件下菌体细胞合成CLA 的研究'>第四章 超临界C0₂条件下菌体细胞合成CLA 的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 菌体细胞的培养与收集
• 4.1.6 超临界设备的操作
• 4.1.7 菌体细胞在超临界条件下的酶促反应
• 4.1.8 菌体形态的电镜观察
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 pH 对CLA 合成的影响
• 4.2.2 温度对CLA 合成的影响
• 4.2.3 底物浓度对CLA 合成的影响
• 4.2.4 细胞浓度对CLA 合成的影响
• 4.2.5 压力对CLA 合成的影响
• 4.2.6 菌体细胞形态的变化
• 4.3 本章小结
• 第五章 富含CLA 凝固型发酵牛乳的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验菌种
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 主要仪器
• 5.1.5 菌种的活化
• 5.1.6 发酵牛乳的制作
• 5.1.7 牛乳中滴定酸度的测定
• 5.1.8 影响发酵牛乳品质各个因素的研究
• 5.1.9 发酵牛乳中脂肪酸组成分析
• 5.1.10 产品的感官评价方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 菌种间配比的影响
• 5.2.2 发酵温度的影响
• 5.2.3 接种量的影响
• 5.2.4 发酵工艺的优化
• 5.2.5 发酵牛乳的脂肪酸分析
• 5.3 本章小结
• 第六章 全文结论与工作展望
• 6.1 全文总结
• 6.2 主要创新点
• 6.3 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 研究生在读期间发表的文章