农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究

论文摘要

改变植物性状表现，转基因是最直接有效的手段。植物遗传转化方法有很多，农杆菌介导法由于其可以转入的片段长、拷贝数少、遗传稳定性好等优点，长期以来一直是科学工作者重点研究的方法。本研究利用玉米优良自交系齐319和R18-599为材料，对农杆菌介导的胚性愈伤遗传转化体系进行了一系列优化；同时分别从玉米和烟草中分离到两段启动子序列Zm13和NTPp13，分别验证了其花粉特异表达特性；将来源于玉米的花粉特异表达启动子序列Zm13与来源于大肠杆菌的脱乙酰酶基因（argE）连接，构建雄性不育嵌合基因，转化玉米自交系齐319，以期获得玉米基因工程雄性不育系，为玉米杂种优势利用创建基础材料。主要结果如下： 1．玉米胚性愈伤遗传转化体系优化实验结果显示，在侵染液中添加0.1％的Tween 20、侵染液浓度OD600为0.4、侵染时间为10min，共培养培养基中添加200μM乙酰丁香酮、200mg／L的L—半胱氨酸，共培养温度22℃、pH值5.2有利于玉米胚性愈伤的遗传转化。 2．用三种不用类型的农杆菌菌株C58、LBA4404和EHA105分别侵染玉米自交系齐319和RR18-599胚性愈伤。结果显示，不同的菌株和自交系间的搭配，其遗传转化效率差异很大，GUS瞬时表达率呈极显著差异(F=24.92**)，抗性愈伤率也呈极显著差异(F=19.43**)。EHA105—齐319组合的遗传转化效率最高，其GUS瞬时表达率最高达到71.1％，最低为37.1％，平均55.5％；其抗性愈伤率最高为20％，最低为10.8％，平均14.4％。另外，对胚性愈伤的抗性筛选时，潮霉素临界浓度以10mg／L为宜。 3．对转GUS基因的T0代抗性植株进行PCR检测，结果显示，在22株再生抗性植株中，PCR阳性率50％，对PCR阳性植株叶片进一步组织化学染色分析显示，PCR阳性植株中均有GUS基因表达。从而证明，外源GUS基因在转基因玉米T0代植株中得到稳定表达，而且验证了PCR检测结果和GUS表达分析结果的一致性。 4．从玉米自交系RR18-599基因组中分离到一段花粉特异表达启动子序列Zm13，将该启动子片段与GUS基因融合后转化烟草，经组织化学分析证实分离到的Zm13启动子片段具有花粉特异表达功能，为进一步创建基因工程雄性不育系奠定基础。 5．从烟草中克隆到一段核甘酸序列NTPp13，与玉米花粉特异表达启动子Zm13序列相似性为96％，而且具有和Zm13启动子完全保守的TATAbox、花粉特异表达元件和表达量增强元件。将该序列与GUS基因连接后转化烟草，在转基因烟草植株中分析功能、特异表达部位及时空表达特性，结果显示NTPp13序列是烟草中与花粉发育相关的一段启动子序列，该启动子引导GUS基因只在烟草花粉和花粉管中表达，

论文目录

• 英文缩写与中英文扩展名
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 玉米遗传转化研究综述
• 1.1 植物遗传转化的方法、原理及优缺点
• 1.1.1 基因枪转化法
• 1.1.2 农杆菌介导法
• 1.1.3 花粉管通道法
• 1.1.4 聚乙二醇介导法
• 1.1.5 电击法
• 1.1.6 脂质体介导法
• 1.2 农杆菌介导的玉米遗传转化的研究历程
• 1.3 影响玉米遗传转化的一些关键因素
• 1.3.1 玉米遗传转化中不同受体再生体系的建立
• 1.3.1.1 不同受体材料对玉米再生的影响
• 1.3.1.2 基因型对玉米体细胞再生能力的影响
• 1.3.1.3 培养条件对玉米体细胞再生能力的影响
• 1.3.2 受体材料、生长状况及基因型对遗传转化的影响
• 1.3.3 不同的培养基成分对玉米遗传转化的影响
• 1.3.3.1 基本培养基对玉米遗传转化的影响
• 1.3.3.2 培养基中附加其它物质对玉米遗传转化的影响
• 1.3.4 农杆菌菌株及载体对遗传转化的影响
• 1.3.5 选择性标记基因对遗传转化的影响
• 1.3.6 其它因素的影响
• 2 植物启动子研究概况
• 2.1 高等植物启动子的分类和结构
• 2.1.1 高等植物启动子的类别
• 2.1.1.1 组成型启动子
• 2.1.1.2 组织或器官特异性启动子
• 2.1.1.3 诱导型启动子
• 2.1.2 高等植物启动子的结构特征
• 2.1.2.1 转录起始位点
• 2.1.2.2 TATA-box
• 2.1.2.3 CAAT-box
• 2.1.2.4 G-box
• 2.1.2.5 增强子和沉默子
• 2.2 烟草中与花发育有关启动子的研究现状
• 2.2.1 烟草花药特异表达启动子
• 2.2.2 烟草花粉特异表达启动子
• 2.3 Zm13基因启动子的研究现状
• 2.4 启动子研究与作物雄性不育
• 3 基因工程创建雄性不育系研究概况
• 3.1 植物雄性不育（male sterility）的类型及遗传机制
• 3.1.1 细胞核不育型（GMS）
• 3.1.1.1 隐性核不育
• 3.1.1.2 显性核不育
• 3.1.2 细胞质雄性不育型（CMS）
• 3.1.2.1 孢子体细胞质雄性不育
• 3.1.2.2 配子体细胞质雄性不育
• 3.2 基因工程创建雄性不育系的研究进展
• 3.2.1 破坏花粉或花药的正常发育创造雄性不育性状
• 3.2.1.1 Mariani雄性不育系统（barnase／barstar—bar系统）
• 3.2.1.2 通过提早降解胼胝质获得植物雄性不育系
• 3.2.1.3 喷施外源物质诱导产生植物雄性不育
• 3.2.1.4 通过其它细胞毒素创建雄性不育
• 3.2.2 利用反义基因技术创造雄性不育性状
• 3.2.3 通过共抑制创造雄性不育
• 3.2.4 通过细菌影响小孢子发育引起雄性不育
• 3.3 argE基因及其应用研究进展
• 第二部分 研究内容
• 第一章 农杆菌介导的玉米胚性愈伤的遗传转化研究
• 第一节 本研究的目的、意义及内容
• 1 本研究的背景、目的及意义
• 2 研究内容
• 第二节 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 供试玉米材料
• 1.2 菌株及质粒
• 1.3 重要试剂、耗材及其它材料
• 1.4 各种培养基及成分
• 1.4.1 玉米培养基母液配方
• 1.4.2 玉米愈伤诱导及后期培养培养基成分
• 1.4.3 玉米愈伤侵染过程所用培养基成分
• 2 实验方法
• 2.1 农杆菌菌株的准备
• 2.2 玉米胚性愈伤的获得及农杆菌介导的遗传转化
• 2.2.1 玉米胚性愈伤的诱导及继代培养
• 2.2.2 农杆菌介导的遗传转化流程
• 2.2.2.1 农杆菌侵染液的准备
• 2.2.2.2 愈伤侵染
• 2.2.2.3 抗性愈伤的筛选及再生
• 2.3 玉米愈伤及转基因植株叶片的GUS表达分析
• 2.3.1 GUS染色液的配制
• 2.3.2 愈伤GUS瞬时表达率分析
• 2.3.3 转基因植株叶片GUS染色
• 2.4 玉米抗性愈伤率分析
• 2.5 转基因植株的分子检测
• 2.5.1 玉米叶片DNA微量提取法
• 2.5.2 抗性植株的PCR检测
• 2.6 玉米胚性愈伤对潮霉素抗性临界浓度的决定
• 第三节 结果与分析
• 1 玉米胚性愈伤对潮霉素抗性临界浓度的决定
• 2 不同菌株及愈伤材料对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 3 不同侵染时间对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 4 不同菌液（侵染液）浓度对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 5 侵染液中不同浓度Tween 20对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 6 不同共培养温度对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 7 不同共培养pH值对玉米愈伤遗传转化的影响
• 8 共培养基中不同浓度乙酰丁香酮对玉米愈伤遗传转化效率影响
• 9 共培养基中不同浓度L—半胱氨酸对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 10 共培养基中不同浓度二硫基苏糖醇对玉米愈伤遗传转化效率的影响
• 0代转基因植株的PCR检测及叶片的GUS表达分析'>11 T₀代转基因植株的PCR检测及叶片的GUS表达分析
• 第四节 讨论
• 1 潮霉素筛选浓度对转基因愈伤存活率的影响
• 2 农杆菌菌株类型对遗传转化的影响
• 3 农杆菌的生长状态对遗传转化的影响
• 4 农杆菌侵染液浓度和侵染时间对愈伤转化的影响
• 5 共培养环境对遗传转化的影响
• 5.1 pH值
• 5.2 温度
• 6 表面活性剂和抗氧化剂在愈伤遗传转化中的作用
• 7 玉米遗传转化过程中阳性转化细胞和再生植株的一致性
• 第五节 小结
• 第二章 玉米花粉特异表达启动子Zm13的分离及功能鉴定、烟草花粉特异表达启动子序列NTPp13的分离、结构特征及时空表达分析
• 第一节 本研究背景、目的意义及技术路线
• 1 本研究背景
• 2 本研究目的及意义
• 2.1 对Zm13启动子活性检测
• 2.2 对野生型烟草中NTPp13序列的功能鉴定
• 3 本研究的技术路线
• 第二节 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株及质粒
• 1.3 重要试剂、耗材及其它材料
• 1.4 培养基及成分
• 2 实验办法
• 2.1 玉米花粉特异表达启动子Zm13及烟草特异表达片段NTPp13的获得
• 2.1.1 玉米叶片和烟草叶片DNA微量提取法
• 2.1.2 玉米中Zm13启动子及烟草中NTPp13片段的PCR扩增
• 2.2 玉米启动子Zm13及烟草启动子片段NTPp13表达载体构建
• 2.2.1 PCR产物回收与纯化
• 2.2.2 目的片段与T载体连接
• 2法制备大肠杆菌DH5α感受态'>2.2.3 CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态
• 2.2.4 蓝白斑筛选平板的制备
• 2.2.5 热激转化法将质粒转入大肠杆菌
• 2.2.6 转化子的鉴定
• 2.2.7 细菌培养、收集以及碱裂解法提取质粒DNA
• 2.2.8 聚乙二醇法沉淀纯化质粒DNA
• 2.2.9 质粒及载体的酶切
• 2.2.10 Zm13及NTPp13片段与载体pBI121连接
• 2.2.11 热激法将质粒载体转入大肠杆菌DH5α感受态以及转化子的鉴定
• 2.2.12 三亲交配法将表达载体pBI121—Zm13（或NTPp13）导入农杆菌
• 2.3 农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草
• 2.4 转基因烟草继代及移栽
• 2.5 转Zm13启动子烟草植株的PCR检测及Zm13启动子活性鉴定
• 2.5.1 转Zm13启动子烟草叶片DNA微量提取法及GUS染色液的配制
• 2.5.2 转Zm13启动子抗性烟草植株的PCR检测
• 2.5.3 Zm13启动子的活性鉴定
• 2.6 转NTPp13-GUS烟草植株的分子检测
• 2.6.1 转NTPp13-GUS抗性烟草植株的PCR检测
• 2.6.2 转NTPp13-GUS烟草植株的PCR—Southern检测
• 2.6.2.1 探针DNA序列的获得
• 2.6.2.2 转基因烟草植株的PCR—Southern检测
• 2.7 NTPp13片段的启动子活性验证及时空特异表达
• 2.7.1 NTPp13片段在烟草花药中的活性验证
• 2.7.2 NTPp13片段的特异表达部位鉴定
• 2.7.3 不同花期NTPp13—GUS表达量分析
• 2.7.4 NTPp13片段启动子活性对温度影响的稳定性分析
• 2.7.5 GUS活性荧光定量方法
• 第三节 结果与分析
• 1 玉米花粉特异表达启动子Zm13的分离及活性鉴定
• 1.1 Zm13启动子的分离
• 1.2 Zm13启动子活性鉴定
• 2 烟草花粉特异表达序列NTPp13的结构和功能分析
• 2.1 NTPp13序列的结构分析
• 2.2 转NTPp13-GUS烟草植株的分子检测
• 2.3 NTPp13序列的启动子活性验证及时空特异表达
• 2.4 NTPp13启动子片段对温度改变的稳定性分析
• 第四节 讨论
• 1 玉米花粉特异表达启动子Zm13在创建雄性不育系中的应用
• 2 对NTPp13启动子序列的研究及意义
• 第五节 小结
• 第三章 基因工程创建玉米雄性不育系的初步研究
• 第一节 本研究目的、意义及技术路线
• 1 本研究目的及意义
• 2 本研究的技术路线
• 第二节 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株及质粒
• 1.3 重要试剂、耗材及其它材料
• 1.4 培养基及成分
• 2 实验方法
• 2.1 脱乙酰酶基因argE的获得
• 2.1.1 大肠杆菌菌株基因组的提取
• 2.1.2 argE基因的获得
• 2.2 玉米花粉特异表达启动子Zm13的获得
• 2.3 玉米表达载体p1300-Zm13-argE的构建
• 2.4 玉米幼胚及胚性愈伤的遗传转化
• 2.4.1 农杆菌介导的玉米愈伤的遗传转化
• 2.4.2 农杆菌介导的幼胚的遗传转化
• 2.5 转基因植株的分子检测
• 2.5.1 抗性植株的PCR检测
• 2.5.2 PCR阳性植株的PCR-Southern检测
• 2.5.2.1 杂交探针的获得
• 2.5.2.2 PCR-Southern杂交过程
• 第三节 结果与分析
• 1 脱乙酰酶基因argE的获得
• 2 玉米表达载体p1300-Zm13-argE的构建
• 3 农杆菌介导的玉米愈伤的遗传转化
• 4 转基因植株的分子检测
• 第四节 讨论
• 1 通过花粉特异启动子创建雄性不育系
• 2 通过外施N-乙酰-草丁膦诱导转argE基因植株雄性不育系策略的优缺点
• 第五节 小结
• 参考文献
• 致谢