LRRC4负性调控SDF-1α/CXCR4生物学轴介导的ERK1/2和AKT通路抑制胶质瘤细胞侵袭

论文摘要

【LRRC4基因和SDF-1α／CXCR4生物学轴的研究背景】LRRC4（leucine-rich repeats containing 4）是我室从染色体7q31-32区域克隆的一个新基因，LRRC4在脑组织中相对特异性表达，是一个与脑胶质瘤级别进展呈负相关的胶质瘤抑制性基因。本实验室前期通过与细胞因子及其受体基因的cDNA微阵列杂交，发现LRRC4在脑胶质瘤U251细胞的重表达，可以明显地下调趋化因子受体基因CXCR4的表达。CXCR4为趋化因子SDF-1α（stromal cell-derived factor—1基质细胞来源因子）的受体。研究表明SDF-1α及其受体CXCR4的过表达与脑胶质瘤的进展呈正相关。SDF-1α通过ERK1／2，AKT信号通路促进脑胶质瘤细胞的增生。CXCR4的阻断剂能抑制脑胶质瘤细胞的增生和侵袭。【LRRC4通过下调SDF-1α／CXCR4生物学轴抑制脑胶质瘤细胞的运动和侵袭】LRRC4在恶性胶质瘤中的表达缺失和CXCR4的过表达均参与了胶质瘤的恶性级别进展。在SDF-1α诱导下，LRRC4转染的U251细胞中CXCR4在mRNA和蛋白表达水平较对照组细胞均明显下调，LRRC4能抑制CXCR4的表达。本研究通过MTT，黏附实验，趋化实验，基质胶侵袭实验，划痕实验和细胞间通讯能力实验，检测到SDF-1α以浓度依赖方式诱导脑胶质瘤U251细胞增殖、趋化、运动和侵袭，最佳浓度为12.5nM。而LRRC4能抑制SDF-1α诱导的脑胶质瘤细胞的增殖、趋化、运动和侵袭，但对SDF-1α（12.5nM）诱导的脑胶质瘤细胞与基质粘附无影响，却抑制瘤细胞与内皮细胞ECV304的粘附。因此，LRRC4通过下调SDF-1α／CXCR4生物学轴抑制脑胶质瘤的运动和侵袭。【LRRC4负性调控SDF-1α／CXCR4生物学轴介导的ERK1／2和AKT信号通路，并通过这两条通路调节MMP-2活性】用外源性SDF-1α（12.5nM）处理U251细胞，分别作用0min，5min，10min，15min，30min，发现SDF-1α可以使U251细胞中ERK1／2以及AKT磷酸化水平明显增高，且呈时间依赖性，15min表达达高峰。LRRC4可以有效抑制ERK1／2以及AKT的磷酸化。ERK通路抑制剂PD98059以及AKT通路抑制剂LY294002能明显抑制ERK1／2以及AKT的活化（阳性对照）。因此，LRRC4能负性调控SDF-1α／CXCR4生物学轴介导的ERK1／2，AKT信号通路。基质金属蛋白酶（MMPs）在肿瘤侵袭转移和血管形成过程中起了很重要的作用。研究表明，一些信号通路如，p38MAPK，NF-κB，PKC，PI-3K激酶及Raf／ERK，JAK／STATs通过调节MMP—2、MMP—9的分泌来影响肿瘤细胞侵袭和转移特性。本研究发现SDF-1α可以增强U251细胞MMP2酶活性，LRRC4明显的抑制了SDF-1α诱导的MMP2的酶活性增加。ERK通路抑制剂PD98059和AKT通路抑制剂LY294002处理均可抑制SDF-1α诱导的MMP2的酶活性增加（阳性对照）。因此，LRRC4能够通过SDF-1α／CXCR4生物学轴介导的ERK1／2和AKT通路抑制MMP-2的酶活性。但对MMP-9的酶活性无影响。【LRRC4诱导脑胶质瘤细胞向星形胶质样细胞分化】与对照组细胞相比（细胞呈梭形，基本无突起），LRRC4转染后的U251细胞形态发生明显变化，细胞胞体缩小，呈圆形，突起明显延长，呈星形胶质样细胞特点。GFAP一直被视为星形细胞特异性标记物，与脑胶质瘤分化程度呈正相关，本研究发现LRRC4转染0251细胞后，GFAP表达明显上调。表明，LRRC4可以诱导脑胶质瘤U251细胞向星形胶质样细胞分化。综上所述，胶质瘤抑瘤基因LRRC4可以通过抑制CXCR4的表达，负性调控SDF-1α／CXCR4生物学轴介导的ERK1／2和AKT通路，抑制胶质瘤U251细胞趋化、运动和侵袭；LRRC4能够诱导U251细胞向星形胶质样细胞分化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 论文正文
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞
• 1.2 菌株和质粒载体
• 1.3 试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 PCR引物
• 2 方法
• 2.1 稳定表达pcDNA3.1和pcDNA3.1-LRRC4的U251细胞株的筛选
• 2.2 RT-PCR
• 2.3 Western Blot
• 2.4 FACS
• 2.5 细胞生长实验（MTT实验）
• 2.6 细胞-基质黏附试验
• 2.7 细胞-内皮黏附试验
• 2.8 趋化实验
• 2.9 细胞迁移实验
• 2.10 Transwell体外侵袭实验
• 2.11 划痕标记染料示踪实验
• 2.12 明胶酶谱分析实验
• 2.13 免疫荧光
• 3. 统计学分析方法
• 第三章 结果
• 3.1 LRRC4对外源性SDF-1处理后脑胶质瘤U251细胞中CXCR4表达的影响
• 3.2 MTT实验检测LRRC4对SDF-1α介导的U251细胞生长的影响
• 3.3.黏附基质实验检测LRRC4对SDF-1α介导的U251细胞黏附FN和Matrigel的影响
• 3.4 黏附内皮实验检测LRRC4对SDF-1α介导的U251细胞黏附ECV304细胞的影响
• 3.5 趋化实验检测LRRC4对SDF-1α介导的脑胶质瘤U251细胞趋化能力的影响
• 3.8 划痕染料示踪实验检测LRRC4对SDF-1α介导的脑胶质瘤U251细胞间通讯功能的影响
• 3.9 LRRC4对SDF-1α介导的ERK1/2和AKT信号转导通路的影响
• 3.10 明胶酶谱实验检测LRRC4对SDF-1α介导的脑胶质瘤U251细胞分泌MMP-2的影响
• 3.11 LRRC4促进U251分化
• 第四章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 缩写词简表
• 致谢
• 个人简介