海洋真菌Halorosellinia sp.(No.1403)产抗癌化合物1403C的发酵工艺系统优化与过程放大

论文摘要

海洋红树林内生真菌Halorosellinia sp.（No.1403）属盐生坚座壳种,1403C（亦称SZ-685C）是其产生的一种蒽醌类次级代谢物。该化合物及其乙酰化产物具有显著抗肿瘤活性,是一种潜在的抗癌候选药物。目前,该化合物正在开展临床前研究,化合物需求量非常大。本文拟通过发酵工艺系统优化与过程放大,实现1403C的高产及大规模生产。首先,以原始培养基为基础,通过单因素实验筛选出有利于1403C合成的碳源、氮源和微量元素,并通过正交优化改良了人工海水组成,初步确定了培养基的主要组分：然后,利用Plackett-Burman设计筛选出作用显著的成分；最后,采用中心组合设计（CCD）实验拟合出1403C产量与显著性因素间的多元回归关系,并预测出理论极值且通过实验验证。最终,优化培养基组成为：葡萄糖12.36 g/L、蛋白胨1.05 g/L、牛肉浸膏6.08 g/L、MnSO4·H2O 0.246 g/L,改良人工海水（40%浓度）。抗癌化合物1403C的摇瓶发酵产量达到2.2 g/L,比原始水平提高了270%。其次,通过调节发酵末期的pH条件可以选择性控制1403C在发酵上清液及菌体外壁的分布情况,放罐时刻的碱性环境使产物富集在菌体部分,便于运输和储存,后续纯化过程无需大孔树脂层析的除杂,节约有机相洗脱液、介质填料及设备能耗,产物收率提高；同时,采用热乙酸超声萃取方式处理发酵液样品并测定1403C产量,该方法操作简单,步骤少,无明显产品损失,产物萃取时间由原来的24 h缩短至2 h。然后,开展了5-L搅拌釜式生物反应器发酵工艺的系统优化。尽管培养基优化后摇瓶发酵中1403C产量达到2.2 g/L,但5-L反应器发酵中却只有0.61g/L,且二者代谢差异非常明显。因此,在5-L反应器发酵中,系统地研究了过程pH控制、接种量、搅拌转速、搅拌桨型和溶氧对1403C合成的影响。通过多参数协同控制,初步形成较为系统的海洋真菌Halorosellinia sp.（No.1403）发酵生产抗癌化合物1403C的5-L反应器发酵控制工艺,具体控制条件为：每升培养基接入菌体净干重0.22 g的二级种子液；发酵过程中短时间维持较低pH（3.8左右）,当碳源即将耗尽之时,pH迅速上升至7.0以上；装备双层六平叶涡轮桨,初始转速400 r/min;初始通气量为0.5 vvm,保证发酵前期（对数生长期和稳定期前期）的最低溶氧不低于30%,发酵后期（稳定期后期和衰亡期）的溶氧维持在30%-40%。最终,5-L反应器发酵中目标产物1403C的产量由最初的0.61 g/L提至1.32 g/L,提高幅度达到116%。最后,根据桨尖线速度（vtip）和初始通气量（vvm）相似的放大原则并参考5-L反应器发酵控制工艺,进行了海洋真菌Halorosellinia sp.（No.1403）的500-L反应器发酵中试实验,使1403C产量由发酵工艺系统优化前的0.23 g/L增至1.1 g/L,增幅达到378%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 丝状真菌
• 1.1.1 丝状真菌的形态
• 1.1.2 丝状真菌的极化生长
• 1.2 真菌发酵工艺
• 1.2.1 培养基优化
• 1.2.2 发酵工艺参数控制
• 1.3 代谢抑制
• 1.3.1 碳分解代谢抑制
• 1.3.2 氮分解代谢抑制
• 1.4 计算流体力学
• 1.5 代谢工程
• 1.6 课题研究背景
• 第2章 海洋真菌Halorosellinia sp.（No.1403）的培养基优化
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 实验菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 培养条件
• 2.2.4 分析检测方法
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 碳源的筛选
• 2.3.2 氮源的筛选
• 2.3.3 微量元素的添加
• 2.3.4 人工海水的优化
• 2.3.5 正交实验初步优化
• 2.3.6 显著性因素分析
• 2.3.7 最速上升实验确定响应面中心点
• 2.3.8 响应面预测结果
• 2.3.9 响应面预测结果的验证试验
• 2.3.10 培养基优化前后摇瓶发酵过程参数对比
• 2.4 本章小结
• 第3章 Halorosellinia sp.（No.1403）摇瓶发酵及产物提取过程的优化
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 实验材料
• 3.2.3 培养条件
• 3.2.4 分析检测方法
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 有机酸添加对产物合成的影响
• 3.3.2 野生型毕赤酵母与Halorosellinia sp.（No.1403）的混合培养
• 3.3.3 产物萃取方式的改进
• 3.3.4 pH对1403C产物分配的影响
• 3.4 本章小结
• 第4章 Halorosellinia sp.（No.1403）的5-L反应器发酵工艺研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和条件
• 4.2.1 实验菌种
• 4.2.2 实验材料和条件
• 4.2.3 培养条件
• 4.2.4 分析检测方法
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 利用优化培养基的5-L反应器发酵初步探索
• 4.3.2 模拟摇瓶pH环境的5-L反应器发酵
• 4.3.3 恒定pH条件下的批发酵实验
• 4.3.4 恒定pH条件下的补料分批发酵实验
• 4.3.5 探究摇瓶和反应器规模的最适接种量
• 4.3.6 最适搅拌转速的确定
• 4.3.7 搅拌桨型的组合优化
• 4.3.8 氧需求分析
• 4.4 本章小结
• 第5章 海洋真菌Halorosellinia sp.（No.1403）的发酵放大
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料与条件
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 实验材料和条件
• 5.2.3 培养条件
• 5.2.4 分析检测方法
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 培养基改进后的500-L中试
• 5.3.2 过程pH调控的500-L中试
• 5.3.3 发酵后期DO控制的500-L中试
• 5.4 本章小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 论文发表
• 致谢