抗氧化治疗阻止非酒精性脂肪性肝炎进展的机制

论文摘要

目的:非酒精性脂肪性肝炎（ nonalcoholic stea- tohepatitis, NASH）是由于肝内脂质沉积而引起的肝细胞坏死、炎症和纤维化等肝损伤,是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）由单纯性肝脂肪变向肝硬化甚至肝癌进展的重要阶段,NASH导致的肝硬化具有与乙、丙型肝炎肝硬化相同的不良预后。国内外学者对其日益关注,研究不断深入,但其病因及发病机制仍不十分清楚,在防治上亦缺乏有效手段。目前认为氧化应激（oxidative stress）是NASH发病的重要因素之一,改善氧化应激可能有助于防止本病的进展。1-氨基苯丙三唑（1-amino- benzotriazole, ABT）及维生素E作为抗氧化剂,能明显减轻组织对氧化应激的敏感性。ABT属于细胞色素P450（cytochro- me P450, CYP）拮抗剂,人体内CYP是位于滑面内质网上的一组混合功能氧化酶系,是肝脏代谢最主要的酶系之一,它主要定位于肝微粒体,CYP在NASH发病中的作用及其机制目前尚未明确。维生素E（vitamin E, Vit E）是一种脂溶性维生素,它能清除自由基,阻断脂质过氧化过程中的链式反应,从而保护细胞免受损害。本研究采用高脂、胆碱-蛋氨酸缺乏（high fat,methionine and choline deficient diet, MCD）饮食建立小鼠NASH模型,应用CYP抑制剂ABT干预治疗,以逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）方法和Western blot法研究细胞色素C（Cytochrome C, Cyt C）、Bax在NASH小鼠肝组织中的表达情况及其与病情进展的关系,以探讨CYP被ABT抑制及阻断脂质过氧化过程中的链式反应后,氧化应激在NASH发病中的作用及其机制,是否可抑制Cyt C及Bax的表达,延缓或阻止NASH的进展,以进一步揭示改善氧化应激在NASH中的作用,为有效防治本病提供新的思路。方法:选用健康雄性C57BL6/J小鼠25只,随机分为5组,每组5只。模型组采用MCD饲料,对照组给予胆碱、蛋氨酸充足的饲料,ABT干预组以MCD饲料加ABT腹腔注射（50mg/kg/d）,维生素E干预组以MCD饲料加喂养维生素E（100mg/kg饲料）,ABT+维生素E干预组以MCD饲料加喂养维生素E（100mg/kg饲料）+ ABT腹腔注射（50mg/kg/d）,喂养3周。血清甘油三酯（triglyceride,TG）,丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）,天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate amino-transferase, AST）采用日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪测定;肝组织病理学变化采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, H&E）,苏丹Ⅳ（SudanⅣ）染色观察;肝组织Cyt C mRNA及Bax mRNA和蛋白表达分别采用RT-PCR和Western blot检测。结果:1动物一般情况:对照组小鼠活泼、毛发有光泽,体重逐渐增加。模型组和ABT干预组、维生素E干预组、ABT+维生素E干预组小鼠体重均下降,尤以模型组明显。对照组小鼠体重、肝湿重均较模型组和干预组增加显著（16.96±1.38g、27.23±1.10g、17.84±0.86g、17.27±0.92g、17.82±0.86g,0.70±0.15g、1.12±0.16g、0.74±0.11g、0.76±0.17g、0.78±0.19g,P<0.05）,模型组体重、肝重与ABT干预组、维生素E干预组、ABT+维生素E干预组相比差异有显著性意义。肝脏指数:模型组与对照组、干预组差别无显著性意义（4.17±0.26、3.91±0.34、3.98±0.28、4.11±0.15、4.13±0.21,P>0.05）。2血清生化学改变:实验动物ALT水平模型组> MCD-+Vit E干预组> MCD-+ABT干预组> MCD+干预组> MCD-+ Vit E+ABT,依次为:245.33±8.02 U/L、184.67±18.23 U/L、161.00±13.89 U/L、151.33±12.86 U/L、129.33±13.65 U/L,P<0.01;实验动物AST水平模型组> MCD-+Vit E干预组> MCD-+ABT干预组> MCD+干预组> MCD-+ Vit E+ABT,依次为:330.67±15.04 U/L、201.67±28.04 U/L、197.67±20.03 U/L、135.00±8.72 U/L、125.67±4.51 U/L,P<0.05;血清TG水平模型组> MCD+干预组> MCD-+ABT干预组>MCD-+Vit E干预组>MCD-+ Vit E+ABT,依次为:0.72±0.04mmol/L、0.56±0.07 mmol/L、0.38±0.03 mmol/L、0.36±0.04 mmol/L、0.33±0.03 mmol/L,P<0.05。3肝脏病理学变化:肉眼观察:对照组小鼠肝脏为红褐色,明亮有光泽。模型组小鼠肝脏体积明显减小,整个肝脏呈浅黄色,与周围组织有粘连,切面油腻、无光泽。干预组小鼠肝脏体积亦有缩小,为红褐色、有光泽。光镜观察:对照组肝细胞轻度脂肪变,无明显炎症表现;模型组肝细胞肿胀、水样变,并形成以大泡性为主的肝细胞脂肪变,伴有小叶内点、灶状肝细胞坏死及以单个核为主的炎症细胞浸润;Vit E及ABT干预组上述肝损伤较模型组均明显减轻,Vit E+ABT干预组肝细胞脂肪变及炎症均较轻微。4肝组织细胞色素C mRNA的表达:实验动物肝组织细胞色素C mRNA表达水平依次为:模型组>对照组>维生素E干预组>ABT干预组>ABT+维生素E干预组（1.26±0.04、1.14±0.08、1.04±0.03、1.00±0.02、0.99±0.01,P<0.01）,差异具有显著性意义。5肝组织细胞色素C蛋白表达情况:实验动物肝组织细胞色素C蛋白水平表达与mRNA表达一致,依次为:模型组>对照组>维生素E干预组>ABT干预组>ABT+维生素E干预组（1.06±0.01、0.96±0.01、0.85±0.02、0.84±0.02、0.80±0.02,P<0.01）,差异具有显著性意义。6肝组织Bax mRNA表达情况:实验动物肝组织Bax mRNA表达水平依次为:模型组>对照组>维生素E干预组>ABT干预组>ABT+维生素E干预组（0.83±0.03、0.77±0.02、0.71±0.01、0.73±0.03、0.70±0.02,P<0.01）,差异具有显著性意义。7小鼠肝组织Bax蛋白表达情况:实验动物肝组织Bax蛋白表达水平依次为:模型组>对照组>维生素E干预组>ABT干预组>ABT+维生素E干预组（0.55±0.02、0.42±0.01、0.40±0.02、0.40±0.01、0.37±0.01,P<0.01）,差异具有显著性意义。结论:1高脂、胆碱-蛋氨酸缺乏饮食3周可诱导具有典型NASH临床特征的肝损伤动物模型,此模型符合人类NASH发病的病理学特点。2 Cyt C和Bax在NASH模型中的表达存在一致变化,推测Cyt C及Bax mRNA及蛋白表达增多为机体氧化应激和脂质过氧化结果,介导的凋亡和激活下游炎症因子促进NASH的进展。3细胞色素P450被ABT抑制和（或）维生素E抗氧化作用后,抑制肝组织Cyt C和Bax mRNA及蛋白的表达,减轻肝细胞脂肪变和肝组织凋亡,阻止NASH的进展,提示其在治疗NASH中存在很大的前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 抗氧化治疗阻止非酒精性脂肪性肝炎进展的机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 非酒精性脂肪性肝炎中Cyt C及Bax与氧化应激的关系
• 致谢
• 个人简历