环境雌激素对小鼠睾丸支持细胞的影响及分子机制的研究

论文摘要

环境雌激素（environmental estrogens）,又称环境内分泌干扰物质（endocrine disruptors,EDs）,是指一类存在环境中能干扰人或动物体内分泌系统并导致异常效应的物质。环境雌激素对人类生存环境的损害正在日益成为人类面临的一个严峻问题。环境雌激素能够影响自然界生物包括人类的健康,导致各种疾病,它的影响是多方面的,其中对雄性生殖系统机能的危害最引人注目。大量动物实验证明,EDs能够影响雄性生殖系统的发育和功能,但其作用机制非常复杂,尤其在分子机制方面目前不甚了解,另外环境雌激素存在较多种类,它们之间还具有协同作用,单独检测某一种环境雌激素活性可能会低估其潜在的危害性,这样就更增加了其危害作用及机理的复杂性,因此有必要对一些常见的环境雌激素进行混合性效应研究。本实验采用组合酶消化、选择性贴壁的方法,分离得到了高纯度的小鼠睾丸支持细胞;在DMEM培养基中添加不同浓度（10-9,10-7,10-5mol/L）的双酚A（bisphenol A,BPA）、大豆异黄酮（Soybean isoflavones）、BPA与大豆异黄酮的共同处理以及这两种环境雌激素分别与睾酮的混合,作用体外培养的小鼠睾丸支持细胞,然后用激光共聚焦显微镜检测细胞色素C（Cytochrome c,cyt C）和Bcl-2家族蛋白中Bax（Homo sapiens Bcl-2 associated protein）、Bcl-2（B-cell leulcemia-lymphoma 2）的表达变化。实验结果显示:1.应用组合酶消化、选择性贴壁的方法,分离得到的小鼠睾丸支持细胞的纯度达到90%以上。2.激光共聚焦显微镜检测结果显示:低浓度（10-9mol/L）的BPA或大豆异黄酮单独处理组与对照组相比,细胞色素C的信号较强,Bcl-2家族蛋白中Bax的信号较弱、Bcl-2的信号较强;随着BPA或大豆异黄酮处理组剂量的升高（10-7,10-5mol/L）,细胞色素C的信号逐渐降低,Bcl-2家族蛋白中Bax的信号逐渐增强、Bcl-2的信号逐渐降低,说明低浓度的BPA或大豆异黄酮对小鼠睾丸支持细胞可能具有促进增殖的作用,高浓度可能促进细胞凋亡。3.与BPA或大豆异黄酮（10-9mol/L）单独处理组相比,BPA与大豆异黄酮低浓度共同处理（10-9mol/L）小鼠睾丸支持细胞后,细胞色素C的信号较弱,Bcl-2家族蛋白中Bax的信号较强、Bcl-2的信号较弱;而高剂量的共同处理组（10-5mol/L）与BPA、大豆异黄酮（10-5mol/L）单独处理组相比,细胞色素C的信号明显增强,Bcl-2家族蛋白中Bax的信号强度明显减弱、Bcl-2的信号明显增强,说明低剂量的BPA与大豆异黄酮混合可能出现毒性叠加反应,而在高剂量时可能发生拮抗现象。4.BPA、大豆异黄酮分别与睾酮共同处理（10-5mol/L）与BPA、大豆异黄酮（10-5mol/L）单独处理组相比,细胞色素C的信号明显增强,Bcl-2家族蛋白中Bax的信号明显减弱、Bcl-2的信号明显增强,说明这两种环境雌激素与睾酮出现明显的拮抗现象。以上结果表明:BPA或大豆异黄酮单独作用体外培养的小鼠睾丸支持细胞时,其作用机制可能相同;BPA与大豆异黄酮共同处理小鼠睾丸支持细胞,在低剂量时可能具有叠加作用,而在高剂量时则具有相互拮抗的效应;EDs还可以通过拮抗雄激素发挥作用。这些激素对睾丸支持细胞的影响可能主要通过线粒体通路来实现,并且Bcl-2家族蛋白也参与其中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 环境雌激素与生殖
• 1.1.1 环境雌激素的概念
• 1.1.2 环境雌激素种类及其所引起的生物效应
• 1.1.3 环境雌激素对雄性生殖系统发育的影响
• 1.2 环境雌激素对雄性生殖系统的作用机制
• 1.2.1 通过“下丘脑-垂体-性腺轴”影响神经内分泌系统
• 1.2.2 雌激素受体（ER）介导的通路
• 1.2.3 拮抗雄激素受体（AR）介导的通路
• 1.2.4 死亡受体-细胞配体凋亡途径
• 1.2.5 其它
• 1.3 细胞凋亡的通路
• 1.3.1 线粒体通路
• 1.3.2 死亡受体通路
• 1.4 细胞色素C 在细胞凋亡中的作用
• 1.5 BCL-2 家族蛋白与细胞色素C 的关系
• 1.6 本研究的目的及意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要器材和试剂
• 2.1.1 主要器材
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验动物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 支持细胞的分离与纯化
• 2.3.2 支持细胞培养
• 2.4 激光共聚焦显微镜检测
• 2.4.1 细胞色素C 的免疫荧光细胞化学流程
• 2.4.2 Bcl-2 家族蛋白的免疫荧光细胞化学流程
• 2.4.3 免疫荧光细胞化学主要溶液配制
• 3. 实验结果
• 3.1 支持细胞的形态学观察与纯度
• 3.2 BPA 对小鼠睾丸支持细胞的作用
• 3.2.1 激光共聚焦显微镜检测细胞色素C 的表达情况
• 3.2.2 Bcl-2 家族蛋白表达情况
• 3.3 大豆异黄酮对小鼠睾丸支持细胞的作用
• 3.3.1 激光共聚焦显微镜检测细胞色素C 的表达情况
• 3.3.2 Bcl-2 家族蛋白表达情况
• 3.4 BPA 与大豆异黄酮联合处理小鼠睾丸支持细胞
• 3.4.1 激光共聚焦显微镜检测细胞色素C 的表达情况
• 3.4.2 Bcl-2 家族蛋白表达情况
• 3.5 环境雌激素与睾酮联合处理小鼠睾丸支持细胞
• 3.5.1 激光共聚焦显微镜检测细胞色素C 的表达情况
• 3.5.2 Bcl-2 家族基因表达情况
• 4. 讨论
• 4.1 支持细胞的分离纯化
• 4.2 环境雌激素对小鼠睾丸支持细胞的影响
• 4.3 环境雌激素的作用机制
• 4.3.1 拮抗雄激素受体介导的通路
• 4.3.2 线粒体通路对小鼠睾丸支持细胞的调控
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 图版及说明
• 攻读硕士期间发表的学术论文