论文摘要
机体器官和组织的pH值一般维持在7.2～7.4。许多免疫相关的病理过程（如急性哮喘、肿瘤、炎症和自身免疫病等）病灶组织局部会出现酸化,从而可能对免疫性疾病的发生产生重要影响。巨噬细胞是机体最重要的免疫细胞之一,其病理生理学意义为：是机体清除病原微生物的第一道防线；可通过细胞间相互作用而调节固有免疫和适应性免疫应答；广泛参与炎症、肿瘤、自身免疫病等免疫相关疾病发生、发展。酸敏感离子通道（acid-sensing ion channel, ASIC）属上皮钠通道/退化蛋白（epithelial sodium channel/degenerin, ENaC/DEC）家族成员,是H+门控的离子通道。目前已知,ASIC主要表达于中枢神经系统和外周神经元,参与痛、触、味觉的形成以及学习记忆。近期文献报道,T细胞、破骨细胞、平滑肌细胞和树突状细胞表面也可表达ASIC。本课题主要探讨微环境酸化对小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derive macrophage, BMM）功能的影响,以及此作用与ASIC的相关性。一、微环境酸化对BMM功能的影响1.微环境酸化促进BMM内吞功能：（1）微环境酸化促进BMM吞饮葡聚糖：在酸性环境（pH 6.5）和生理环境（pH 7.3）下,使用FITC标记的葡聚糖检测BMM吞饮功能。结果发现：BMM吞饮能力与FITC-葡聚糖浓度呈正相关,且酸性环境（pH6.5）可增强BMM吞饮作用。应用FITC-葡聚糖（1000μg/ml）分析时间梯度,结果显示：FITC-葡聚糖在BMM内聚集呈时间依赖性,共孵育30 min后酸化组（pH 6.5）与生理组（pH 7.3）出现统计学差异（n=6, P<0.05）。提示：微环境酸化促进BMM吞饮FITC-葡聚糖。（2）微环境酸化促进BMM内吞IgG包被乳胶颗粒：BMM内吞葡聚糖主要依赖吞饮形式而实现,故本课题应用IgG包被乳胶颗粒进一步观察微环境酸化对IgG所介导内吞的影响。结果显示：BMM与IgG包被乳胶颗粒共孵育5 min,酸化组（pH 6.5）多数BMM内吞6个以上颗粒,生理组（pH 7.3）多数BMM仅内吞0～2个颗粒,且酸化组（pH 6.5）比生理组（pH 7.3）的吞噬指数高55.8%（n=6,P<0.05）。以上结果提示：微环境酸化可增强BMM调理内吞功能。2.微环境酸化促进BMM表面CD80、CD86、MHC 11分子表达将生理状态下（pH 7.3,5% CO2）诱导分化的BMM置于酸化环境（pH 6.5培养基）培养3 h（37℃,7% CO2）,流式细胞术检测结果显示：微环境酸化可上调BMM表面CD80、CD86、MHCⅡ表达。3.微环境酸化促进BMM分泌IL-10,但对BMM分泌TNF-a无影响BMM分别在生理环境（pH 7.3,5% CO2）和酸化环境（pH 6.5,7% CO2）培养3h,采集培养上清,离心去除细胞碎片,-80℃保存,分别检测IL-10和TNF-α水平。结果显示：酸化环境可刺激BMM分泌IL-10,但对TNF-α分泌无影响。二、微环境酸化调控BMM功能与ASIC相关1.BMM表达ASIC采集诱导分化的BMM,提取细胞总RNA和总蛋白,借助RT-PCR和Western blot分别检测ASIC mRNA和蛋白表达；借助细胞免疫荧光技术检测BMM内ASIC分布。结果显示：ASIC1和ASIC3主要表达于BMM胞质中,BMM不表达ASIC2。2.微环境酸化促进BMM吞饮葡聚糖与ASIC相关应用ASIC阻断剂阿米洛利（amiloride,100μM）探讨ASIC是否参与微环境酸化促进BMM吞饮葡聚糖的作用,结果发现：在pH 7.3培养基中,阿米洛利预处理BMM30 min,其对生理组BMM（pH 7.3）吞饮FITC-葡聚糖无影响（n=6,P>0.05）；而阿米洛利预处理可明显抑制酸化组（pH 6.5）BMM吞饮作用（n=6,P<0.05）。提示：微环境酸化上调BMM吞饮功能与ASIC相关。3.微环境酸化上调BMM相关膜分子的表达与ASIC相关应用阿米洛利（100μM）,探讨微环境酸化上调BMM膜分子表达与ASIC的相关性。生理组（pH 7.3）用阿米洛利预处理BMM 30 min（37℃,5% CO2）,然后换用pH6.5的培养基培养3 h（37℃,7% CO2）,通过流式细胞术检测CD80、CD86、MHC 11分子表达。结果显示：酸化阻断组（pH 6.5+阿米洛利）与单纯酸化组（pH 6.5）组相比,上述膜分子表达明显下调（n=6,P<0.05）,而与生理组（pH 7.3）无显著差异（n=6, P>0.05）。提示：微环境酸化上调BMM膜分子表达的作用与ASIC相关。4.非甾体抗炎药可抑制微环境酸化对BMM膜分子表达的上调文献报道,非甾体抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID）可抑制多种神经元ASIC电流。本研究应用NSAID分析BMM表面ASIC的功能。应用布洛芬（ibuprofen,200μM）或双氯芬酸（diclofenac,200μM）预处理BMM（pH 7.3,5% CO2,30 min）,然后酸化组换用pH 6.5的培养基培养3h（37℃,7% CO2）,流式细胞术检测CD80、CD86、MHCⅡ表达。结果显示：NSAID预处理后,酸化组BMM膜分子表达明显下调（n=6,P<0.05）,而生理组BMM无明显改变（n=6,P>0.05）。提示：微环境酸化上调BMM膜分子表达的作用与ASIC相关。结论1.微环境酸化可促进巨噬细胞的吞噬功能、膜分子表达和分泌IL-10；2.BMM表达ASIC1和ASIC3；3.微环境酸化对BMM功能的调控作用与ASIC相关。
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