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绒毛膜癌转移基因的筛选及沉默相关基因对其侵袭力影响的研究

2020-11-28阅读(969)

绒毛膜癌转移基因的筛选及沉默相关基因对其侵袭力影响的研究

论文摘要

第一章高低侵袭力绒毛膜癌细胞株差异表达基因的筛选和鉴定目的采用基因芯片技术比较高、低侵袭力绒毛膜癌细胞株JEG-3和JAR的基因表达谱,以筛选出与绒毛膜癌侵袭转移相关的基因,为阐明绒毛膜癌侵袭转移的分子机制提供理论依据。方法（1）应用MTT和Matrigel体外侵袭试验检测不同人绒毛膜癌细胞系JEG-3与JAR之间增殖能力和侵袭能力的差异;（2）提取绒毛膜癌细胞株JEG-3和JAR的总RNA,反转录制备杂交探针,运用基因芯片进行杂交,杂交信号用Agilent Scanner扫描,用Imagene软件和Genespring软件分析和处理数据;（3）应用RT-PCR技术检测小窝蛋白-1（CAV-1）和血管内皮细胞生长因子B（VEGF-B）在JEG-3和JAR绒毛膜癌细胞株中的表达情况,进而验证基因芯片结果的可信度。结果（1）JEG-3和JAR细胞之间增殖能力的差异无显著性（P＞0.05）,但JEG-3细胞的侵袭能力显著高于JAR细胞（P＜0.05）;（2）对绒毛膜癌JEG-3和JAR细胞株的基因表达谱分析,发现两者表达差异显著的基因有742个,其中在JEG-3细胞中321个基因表达上调,422个基因表达下调,上调基因中与细胞侵袭转移能力有关的基因有51个,其中差异最显著的前五位分别是纤维连接蛋白（FN）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）、小窝蛋白-1（CAV-1）和血管内皮细胞生长因子B（VEGF-B）;（3）CAV-1和VEGF-B mRNA在JEG-3细胞中的表达水平显著高于在JAR细胞中的表达水平,结果与基因芯片结果一致。结论（1）多个侵袭转移相关基因的表达在绒毛膜癌JEG-3和JAR细胞间存在着差异;（2）基因芯片技术能有效地分析各细胞系的基因表达谱、为研究绒毛膜癌转移机制提供新的途径。第二章靶向Caveolin-1 shRNA载体的构建和沉默效应观察目的设计合成针对Caveolin-1基因的shRNA质粒载体,转染人绒毛膜癌高侵袭力细胞JEG-3,应用RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中Caveolin-1基因,建立可用于研究Caveolin-1基因功能的JEG-3细胞模型。研究Caveolin-1 shRNA转染对人绒毛膜癌高侵袭力细胞株JEG-3中Caveolin-1表达及其对JEG-3细胞在体内、外浸润和转移能力的影响。旨在进一步明确Caveolin-1在人绒毛膜癌进展过程中的作用及机制,探讨将Caveolin-1作为靶分子,运用shRNA技术对人绒毛膜癌进行基因治疗的可行性。方法（1）构建靶向抑制Caveolin-1基因表达的短发夹双链RNA（shRNA）真核表达载体pshRNA-Caveolin-1;（2）采用脂质体转染法将载体导入人绒毛膜癌高侵袭力细胞JEG-3中,利用G-418对转染细胞JEG-3进行稳定表达克隆筛选,获得稳定持续表达shRNA的JEG-3细胞;（3）用RT-PCR和Western Blot方法分别从mRNA和蛋白水平观察RNA干扰对Caveolin-1表达的抑制效应;（4）应用Matrigel体外侵袭试验检测Caveolin-1 shRNA对绒毛膜癌细胞的体外侵袭能力的影响;（5）建立裸鼠皮下异种移植模型,观察Caveolin-1 shRNA对绒毛膜癌细胞的体内侵袭、转移能力的影响。结果（1）成功构建靶向抑制Caveolin-1基因的shRNA载体,并经测序证实;（2）建立可用于研究Caveolin-1基因功能的JEG-3细胞模型;（3）发现转染pshRNA-Caveolin-1的JEG-3细胞中Caveolin-1 mRNA及蛋白质的表达比空白组和阴性对照组JEG-3细胞中Caveolin-1 mRNA及蛋白质的表达均明显下降,差异具有显著性（P＜0.05）;（4）通过Matrigel体外侵袭试验证明抑制Caveolin-1基因在JEG-3细胞中的表达可降低JEG-3细胞的体外侵袭能力（P＜0.05）;（5）在对裸鼠模型研究中发现,抑制Caveolin-1基因在JEG-3细胞中的表达可使裸鼠皮下肿瘤的大小降低（P＜0.05）,肿瘤细胞肺转移的发生率降低（P＜0.05）。结论（1）细胞内表达shRNA可长期敲低靶基因的表达,可建立较理想的基因功能研究细胞模型。（2）Caveolin-1基因与人绒毛膜癌侵袭、转移相关,可能是一种新的肿瘤治疗靶分子。（3）RNA干扰有望为人绒毛膜癌基因治疗提供新策略。第三章靶向VEGF-B shRNA载体的构建和沉默效应观察目的:研究VEGF-B shRNA转染对人绒毛膜癌高侵袭力细胞株JEG-3中VEGF-B表达及JEG-3细胞体内外侵袭、转移、促进血管生成能力的影响。旨在进一步明确VEGF-B在人绒毛膜癌进展过程中所起的作用及机制,探讨将VEGF-B作为靶分子,运用shRNA技术对人绒毛膜癌基因治疗的可行性。方法:（1）构建靶向抑制VEGF-B基因表达的短发夹双链RNA（shRNA）真核表达载体pshRNA-VEGF-B;（2）采用脂质体转染法将载体导入人绒毛膜癌高侵袭力细胞JEG-3中,利用G-418对转染细胞JEG-3进行稳定表达克隆筛选,获得稳定持续表达shRNA的JEG-3细胞;（3）用RT-PCR和Western Blot方法分别从mRNA和蛋白水平观察RNA干扰对VEGF-B表达的抑制效应;（4）应用Matrigel体外侵袭试验检测VEGF-B shRNA对绒毛膜癌细胞的体外侵袭能力的影响;（5）建立裸鼠皮下异种移植模型,观察VEGF-B shRNA对JEG-3细胞侵袭转移能力的影响;（6）采用免疫组织化学技术,检测移植瘤组织中VEGF-B的表达情况以及CD34标记的MVD表达情况。结果:（1）成功构建靶向抑制VEGF-B基因的shRNA载体,并经测序证实;（2）建立可用于研究VEGF-B基因功能的JEG-3细胞模型;（3）发现转染pshRNA-VEGF-B的JEG-3细胞中VEGF-B mRNA及蛋白质的表达比空白组和阴性对照组JEG-3细胞中VEGF-B mRNA及蛋白质的表达均明显下降,差异具有显著性（P＜0.05）;（4）通过Matrigel体外侵袭试验证明抑制VEGF-B基因在JEG-3细胞中的表达可降低JEG-3细胞的体外侵袭能力（P＜0.05）;（5）在对裸鼠模型研究中发现,抑制VEGF-B基因在JEG-3细胞中的表达可使裸鼠皮下肿瘤的大小降低（P＜0.05）,肿瘤细胞肺转移的发生率亦有降低（P＜0.05）;（6）VEGF-B在空白组和阴性对照组移植瘤中的表达较转染组高（P＜0.05）,MVD在空白组和阴性对照组移植瘤中高表达,在转染组移植瘤中表达降低（P＜0.05）;（7）相关性分析显示VEGF-B蛋白表达水平与绒毛膜癌血管生成能力之间成正相关。结论:（1）细胞内表达shRNA可长期敲低靶基因的表达,可建立较理想的基因功能研究细胞模型。（2）VEGF-B在人绒毛膜癌中的表达与MVD呈正相关,提示微血管的形成与VEGF-B的调控有关,MVD增高是人绒毛膜癌发生侵袭和远处转移的基础。（3）由shRNA介导的RNAi技术可能是一种有效的肿瘤基因治疗新方法。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略语说明
  • 前言
  • 第一章 高低侵袭力绒毛膜癌细胞株差异表达基因的筛选和鉴定
  • 1.1 前言
  • 1.2 实验材料
  • 1.2.1 实验对象
  • 1.2.2 主要仪器及设备
  • 1.2.3 主要试剂及原料
  • 1.3 实验方法
  • 1.3.1 细胞增养
  • 1.3.2 噻唑盐比色实验（即MTT）法
  • 1.3.3 Matrigel体外侵袭试验（Matrigel Invasion Assay）
  • 1.3.4 构建基因芯片
  • 1.3.5 半定量RT-PCR方法验证差异基因
  • 1.4 统计学处理
  • 1.5 结果
  • 1.5.1 绒毛膜癌JEG-3细胞和JAR细胞增殖能力的差异
  • 1.5.2 绒毛膜癌JEG-3细胞和JAR细胞之间侵袭能力的差异
  • 1.5.3 绒毛膜癌JEG-3细胞和JAR细胞RNA质量的鉴定
  • 1.5.4 基因芯片杂交结果
  • 1.6 讨论
  • 1.6.1 滋养层细胞的侵袭
  • 1.6.2 绒毛膜癌细胞侵袭力的鉴定
  • 1.6.3 绒毛膜癌细胞侵袭能力相关基因的筛选
  • 1.7 小结
  • 参考文献
  • 第二章 靶向Caveolin-1 shRNA载体的构建和沉默效应观察
  • 2.1 前言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 实验对象
  • 2.2.2 主要仪器及设备
  • 2.2.3 主要试剂及原料
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 细胞培养
  • 2.3.2 构建针对CAV-1基因的shRNA真核表达载体pshRNA-CAV-1
  • 2.3.3 细胞传染和筛选稳定表达shRNA细胞
  • 2.3.4 RT-PCR方法检测CAV-1 mRNA在shRNA组、阴性对照组、空白组JEG-3细胞中的表达差异
  • 2.3.5 Western Blot方法检测CAV-1蛋白在shRNA组、阴性对照组、空白组JEG-3细胞中的表达差异
  • 2.3.6 Tanswell法检测CAV-1shRNA对JEG-3细胞的体外侵袭能力的影响
  • 2.3.7 裸鼠皮下异种移植模型和肺转移模型观察CAV-1shRNA对JEG-3细胞的体内侵袭转移能力的影响
  • 2.4 统计学处理
  • 2.5 结果
  • 2.5.1 成功构建CAV-1基因真核表达载体pshRNA-CAV-1
  • 2.5.2 CAV-1 shRNA转染至JEG-3细胞成功性的鉴定
  • 2.5.3 RT-PCR检测各组别JEG-3细胞中CAV-1 mRNA的表达差异
  • 2.5.4 Western Blot各组别JEG-3细胞中CAV-1蛋白的表达差异
  • 2.5.5 Tanswell法检测CAV-1 shRNA对JEG-3细胞体外侵袭能力的影响
  • 2.5.6 裸鼠皮下异种移植模型和肺转移模型观察CAV-1 shRNA对JEG-3细胞的体内侵袭能力的影响
  • 2.6 讨论
  • 2.6.1 CAV-1基因与恶性肿瘤侵袭转移的关系
  • 2.6.2 RNAi技术的研究进展
  • 2.6.3 CAV-1基因在人绒毛膜癌侵袭、转移过程中的作用
  • 2.7 小结
  • 参考文献
  • 第三章 靶向VEGF-B shRNA载体的构建和沉默效应观察
  • 3.1 前言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 实验对象
  • 3.2.2 主要仪器及设备
  • 3.2.3 主要试剂及原料
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 细胞培养
  • 3.3.2 构建针对VEGF-B基因的shRNA真核表达载体pshRNA-VEGF-B
  • 3.3.3 细胞转染和筛选稳定表达shRNA细胞
  • 3.3.4 RT-PCR方法检测VEGF-B mRNA在shRNA组、阴性对照组、空白组JEG-3细胞中的表达差异
  • 3.3.5 Western Blot方法检测VEGF-B蛋白在shRNA组、阴性对照组、空白组JEG-3细胞中的表达差异
  • 3.3.6 Tanswell法检测VEGF-B shRNA对JEG-3细胞的体外侵袭能力的影响
  • 3.3.7 裸鼠皮下异种移植模型和肺转移模型观察VEGF-B shRNA对JEG-3细胞的体内侵袭转移能力的影响
  • 3.4 统计学处理
  • 3.5 结果
  • 3.5.1 成功构建VEGF-B基因真核表达载体pshRNA-VEGF-B
  • 3.5.2 VEGF-B shRNA转染至JEG-3细胞成功性的鉴定
  • 3.5.3 RT-PCR检测各组别JEG-3细胞中VEGF-B mRNA的表达差异
  • 3.5.4 Western Blot各组别JEG-3细胞中VEGF-B蛋白的表达差异
  • 3.5.5 Tanswell法检测VEGF-B shRNA对JEG-3细胞体外侵袭能力的影响
  • 3.5.6 裸鼠皮下异种移植模型和肺转移模型观察VEGF-B shRNA对JEG-3细胞的体内侵袭能力的影响
  • 3.5.7 免疫组化结果判定
  • 3.5.8 裸鼠皮下移植瘤中VEGF-B蛋白的表达水平与肿瘤MVD之间的相关性分析
  • 3.6 讨论
  • 3.6.1 VEGF-B与肿瘤相关性研究
  • 3.6.2 人绒毛膜癌侵袭、转移过程中VEGF-B基因的促血管生成作用
  • 3.7 小结
  • 参考文献
  • 综述一 Caveolin-1在相关疾病中的研究进展
  • 1.Caveolae和Caveolin-1概述
  • 1.1 Caveolae
  • 1.2 Caveolin-1的结构特点及生理功能
  • 2.Caveolin-1与疾病
  • 2.1 Caveolin-1与病原体感染
  • 2.2 Caveolin-1与糖尿病
  • 2.3 Caveolin-1与心血管疾病
  • 2.4 Caveolin-1与肿瘤
  • 3.结论与展望
  • 参考文献
  • 综述二 VEGF-B—促血管新生和肿瘤转移
  • 1.VEGF-B的基因位置与分子结构
  • 2.VEGF-B的分泌及表达
  • 3.VEGF-B的临床研究
  • 3.1 VEGF-B与肿瘤相关性研究
  • 3.2 VEGF-B与其受体在心血管方面的相关性研究
  • 3.3 VEGF-B在妇科疾病中的研究进展
  • 4.VEGF-B的研究意义及应用前景
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间主要研究成果

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