刺参Apostichopus japonicus生态免疫与夏眠的基础研究

论文摘要

针对目前刺参养殖过程中亟需解决的种质、环境和产品品质之间日益突出的矛盾,本论文从刺参的自身防御和内分泌机制入手,比较系统地研究了环境胁迫与细胞免疫和应激激素之间的作用机理;并从生理和分子的角度对刺参的夏眠机理进行了初步研究,主要研究成果如下:1.查阅国内外大量文献资料,较为系统地综述了海参的免疫体系、生态免疫学研究进展、当前夏眠机理的研究状况和刺参夏眠的基础研究。对刺参生态免疫及其夏眠机理研究提出了新的见解和思路。2.研究了温度(0、8、16、24、32℃)和盐度(20、25、35)的急性胁迫(72h)作用对刺参免疫指标的影响。刺参体腔液内几种免疫酶类活性受升温胁迫影响显著;而降温胁迫的影响并不显著。高盐胁迫可使刺参体腔液细胞吞噬活性、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著变化,而对髓过氧化物酶和溶菌酶活性都没有显著影响。从这几种免疫指标变化情况来看,温度胁迫对刺参的影响要强于盐度胁迫,且高温胁迫的影响要强于低温胁迫。3.研究了温度(8、16、24℃)、盐度(20、25、35)和露空等急性胁迫(24h)作用对刺参体腔液儿茶酚胺类激素含量的影响。急性温度胁迫能够显著影响刺参体腔液内肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的含量;而盐度和露空胁迫对刺参体腔液肾上腺素含量、去甲肾上腺素含量以及多巴胺含量都没有产生显著影响。4.完成了刺参体腔液几种酶类变化的周年测定(2006年7月到2007年6月)。一年内刺参体腔液内几种酶类变化的转折点为9月份,10月份,1月份,2月份,4月份和5月份。刺参体腔液内几种酶类活性变化与温度和盐度等环境因素并不存在简单的相关关系,因此推测这些显著变化并不是单一温度、盐度等因素作用的结果,还可能与刺参生长、繁殖及其它环境因素的作用有关。5.开展了夏眠期间刺参免疫指标的现场研究(2006年7月到11月)。在此期间刺参体腔液细胞总数显著下降;刺参体腔液内免疫相关酶类均在8月份、9月份达到最高值;肾上腺素和去甲肾上腺素的含量均在8月下旬和11月下旬显著升高,而多巴胺含量则没有显著变化。刺参完全进入夏眠的8、9月份,体腔液内各项免疫指标也都具有显著变化,说明夏眠对刺参机体的免疫状态产生影响。6.探讨了刺参夏眠前后肠道基因表达的差异(2007年7月至12月)。抑制消减杂交实验结果表明接头连接效率大于50%,说明连接效率较高。消减效率分析结果表明,消减后进行cDNA保守序列扩增比未消减落后约10个循环才能明显看到扩增产物,说明对共同序列的消减效率比较高。利用抑制消减杂交技术成功构建了符合技术要求的夏眠刺参与未夏眠刺参肠道抑制消减杂交基因文库。

论文目录

• 前言
• 摘要
• Abstract
• 第一章 刺参生态免疫与夏眠的研究进展
• 1.1 前言
• 1.2 海参的生理防御机制
• 1.2.1 海参体腔细胞的组成及其防御功能
• 1.2.2 海参体液中的免疫因子
• 1.3 生态免疫概念
• 1.4 夏眠机理的研究进展
• 1.4.1 能量代谢
• 1.4.2 信号转导
• 1.4.3 代谢相关酶类
• 1.4.4 基因表达
• 1.4.5 刺参的夏眠特征
• 1.4.6 影响刺参夏眠的因素
• 1.5 本论文的研究目的、意义及研究思路
• 1.5.1 研究目的及意义
• 1.5.2 研究思路
• 1.6 本章小结
• 第二章 环境胁迫对刺参免疫机能的影响
• 2.1 前言
• 2.2 温度胁迫
• 2.2.1 材料和方法
• 2.2.2 样品的测定
• 2.2.3 统计分析
• 2.2.4 结果与分析
• 2.2.5 讨论
• 2.3 盐度胁迫
• 2.3.1 材料和方法
• 2.3.2 样品的测定
• 2.3.3 统计分析
• 2.3.4 结果分析
• 2.3.5 讨论
• 2.4 本章小结
• 第三章 环境胁迫对刺参体腔液激素含量的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.3 统计分析
• 3.4 结果分析
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第四章 刺参体腔液几种免疫指标的周年变化
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.3 样品的测定
• 4.4 统计分析
• 4.5 结果分析
• 4.6 讨论
• 4.7 本章小结
• 第五章 刺参夏眠期间生态免疫特征变化
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料
• 5.3 样品测定
• 5.4 统计分析
• 5.5 结果分析
• 5.6 讨论
• 5.7 本章小结
• 第六章 夏眠前后刺参肠道消减文库的构建
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料及试剂
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 总RNA 提取
• 6.3.2 反转录（SMART 技术）
• 6.3.3 PCR 扩增
• 6.3.4 PCR 产物纯化
• 6.3.5 Rsa I 消化酶切
• 6.3.6 接头5’磷酸化
• 6.3.7 连接接头
• 6.3.8 第一次杂交
• 6.3.9 第二次杂交
• 6.3.10 PCR 扩增
• 6.3.11 消减效率分析
• 6.3.12 消减杂交文库的构建
• 6.4 结果分析
• 6.4.1 刺参肠道总RNA 提取及反转录结果的检测
• 6.4.2 Rsa I 酶切
• 6.4.3 接头连接效率检测
• 6.4.4 消减产物第二次PCR 结果
• 6.4.5 消减效率检测
• 6.4.6 消减文库中插入片段的PCR 鉴定
• 6.5 讨论
• 6.5.1 抑制消减技术
• 6.5.2 消减文库结果初步分析
• 6.6 本章小结
• 第七章 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 存在问题
• 7.3 研究展望
• 参考文献
• 博士期间文章撰写与发表情况
• 致谢