用离子交换法从重组大肠杆菌发酵液中分离5-氨基乙酰丙酸

论文摘要

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是所有四氢吡咯化合物的共同前体，广泛存在于细菌、真菌及动植物的细胞中，在农业和医学上应用前景广阔。利用基因重组技术实现ALA的批量生产是合成ALA的新技术。目前对于从发酵液中分离ALA的研究鲜有报道。因此本文主要探讨了用离子交换法分离ALA的工艺。ALA属于氨基酮酸类化合物，分离过程中需要考虑到ALA在发酵液中的稳定性。在低温酸性状态下，ALA溶液较稳定。色素的存在，给ALA的分离纯化和树脂的再生带来诸多不便。本文对重组大肠杆菌发酵液的脱色工艺进行了考察。结果表明，活性炭粉末HC-772脱色效果最好，并进一步优化了脱色条件：活性炭用量2％-3％，发酵液pH5.0，接触时间15-20min。该工艺脱色率达到95.2％，回收率91.6％。5-氨基乙酰丙酸可采用离子交换法进行初步的分离纯化。筛选到强酸性阳离子交换树脂001×7对ALA具有较大的静态交换容量，并且吸附过程动力学性能良好。通过分析ALA在001×7上的穿透曲线和吸附等温线，确定发酵液的吸附pH为5.0。初步采用高效液相色谱法在210nm下测定洗脱液中ALA的纯度。对离子交换过程进行优化，确定最佳操作条件为：吸附流速2BV·h-1，洗脱流速1.5BV·h-1，洗脱剂盐酸浓度1.5M。该条件下，洗脱富集液最高浓度达到30.97g·L-1，HPLC纯度51.78％，回收率85.52％。并采用Φ34×520mm的离子交换柱对优化后的工艺进行放大，完成了ALA的初步分离。进一步探索了ALA粗品的精制纯化工艺。经过乙醇洗杂，提高了ALA粗品的纯度。最终确定采用甲醇溶解，乙醚沉淀ALA粗品的方法进行精制，ALA粗品的HPLC纯度由36.86％增至90.16％。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 生物下游加工技术
• 1.3 生化生产分离的特点及要求
• 1.4 吸附和离子交换过程
• 1.4.1 吸附剂和离子交换剂
• 1.4.1.1 吸附剂
• 1.4.1.2 离子交换剂
• 1.4.2 离子交换剂的性能评价
• 1.4.3 离子交换吸附平衡
• 1.4.4 离子交换动力学概述
• 1.4.5 离子交换法分离氨基酸简介
• 1.5 氨基酸的精制纯化研究进展
• 1.6 5-氨基乙酰丙酸概述
• 1.6.1 5-氨基乙酰丙酸及其盐酸盐的基本性质
• 1.6.2 5-氨基乙酰丙酸的用途
• 1.6.2.1 5-氨基乙酰丙酸在农业上的用途
• 1.6.2.2 5-氨基乙酰丙酸在医学诊断上的应用
• 1.6.3 化学法合成5—氨基乙酰丙酸
• 1.6.4 生物法合成5-氨基乙酰丙酸
• 1.6.4.1 碳四途径合成5-氨基乙酰丙酸
• 1.6.4.2 碳五途径合成5-氨基乙酰丙酸
• 1.6.4.3 5-氨基乙酰丙酸高产菌株的诱变育种及代谢修饰
• 1.6.4.4 重组大肠杆菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸
• 1.6.5 5-氨基乙酰丙酸的稳定性研究
• 1.6.5.1 5-氨基乙酰丙酸的不稳定性机理
• 1.6.5.2 5-氨基乙酰丙酸不稳定性引发因素的研究
• 1.6.5.3 不同领域对5-氨基乙酰丙酸稳定性的研究
• 1.6.6 5-氨基乙酰丙酸的分离研究现状
• 1.7 研究方向及研究内容
• 1.7.1 研究方向
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验药品
• 2.1.3 发酵培养实验材料
• 2.1.3.1 菌株
• 2.1.3.2 培养基
• 2.1.3.3 流加前体物
• 2.1.4 脱色剂
• 2.1.5 离子交换剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因工程菌的培养
• 2.2.1.1 种子培养
• 2.2.1.2 发酵罐培养
• 2.2.2 发酵液的预处理
• 2.2.3 离子交换树脂预处理
• 2.2.4 脱色效果的评价
• 2.2.4.1 色素测定波长的确定
• 2.2.4.2 脱色剂性能的考察方法
• 2.2.4.3 脱色剂的静态筛选
• 2.2.4.4 脱色剂的动态筛选
• 2.2.5 离子交换树脂的静态筛选
• 2.2.5.1 树脂静态交换容量的确定
• 2.2.5.2 静态饱和等温吸附曲线的测定
• 2.2.6 离子交换法分离ALA的动态研究
• 2.2.6.1 离子交换吸附洗脱ALA
• 2.2.6.2 洗脱过程回收率计算
• 2.2.7 分析方法
• 2.2.7.1 甘氨酸的分析
• 2.2.7.2 ALA的定量分析
• 第三章 5-氨基乙酰丙酸发酵液脱色工艺的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 发酵液的预处理
• 3.2.2 仪器与试剂
• 3.2.3 脱色率及脱色回收率的测定
• 3.2.4 分光光度法测定发酵液及脱色液中ALA的含量
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵液中色素测定方法的建立
• 3.3.2 脱色剂的静态筛选实验
• 3.3.3 脱色树脂的动态实验
• 3.3.4 活性炭HC-772的脱色研究
• 3.3.4.1 发酵液的pH及接触时间对HC-772脱色效果的影响
• 3.3.4.2 HC-772的用量及接触时间对脱色效果的影响
• 3.3.4.3 活性炭粉末HC-772脱色条件优化
• 3.3.4.4 脱色过程对发酵液纯度的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 离子交换树脂的筛选及离子交换动力学研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 发酵液的预处理
• 4.3.1.1 菌体的分离
• 4.3.1.2 发酵液的脱色工艺
• 4.3.2 离子交换树脂的静态筛选
• 4.3.3 ALA在离子交换树脂上的离子交换动力学
• 4.3.3.1 离子交换动力学
• 4.3.3.2 ALA在离子交换树脂上的离子交换速率曲线
• 4.3.4 离子交换树脂穿透曲线的测定
• 4.3.4.1 不同离子交换树脂穿透曲线的测定
• 4.3.4.2 发酵液脱色前后穿透曲线的变化
• 4.3.4.3 pH值对ALA在001×7上穿透曲线的影响
• 4.3.5 离子交换吸附等温线
• 4.3.5.1 不同温度下的离子交换吸附等温线
• 4.3.5.2 不同pH值下的离子交换吸附等温线
• 4.3.5.3 ALA在001×7树脂上的离子交换平衡模型
• 4.4 本章小结
• 第五章 离子交换法分离5-氨基乙酰丙酸
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 离子交换法提取ALA
• 5.3.2 洗脱液纯度的提高
• 5.3.2.1 离子交换过程中纯度测定方法的建立
• 5.3.2.2 洗脱剂的浓度对洗脱过程的影响
• 5.3.2.3 洗脱流速对洗脱过程的影响
• 5.3.3 离子交换法分离ALA的扩大实验
• 5.3.3.1 离子交换法分离ALA的扩大实验之一
• 5.3.3.2 离子交换法分离ALA的扩大实验之二
• 5.3.3.3 离子交换法分离ALA的扩大实验之三
• 5.3.3.4 离子交换法分离ALA三次扩大实验的比较
• 5.4 本章小结
• 第六章 ALA盐酸盐的精制纯化
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 ALA分离相关的物化性质
• 6.3.2 ALA洗脱液浓缩方法的探索
• 6.3.3 ALA粗品的精制纯化
• 6.3.3.1 ALA粗产品的获得
• 6.3.3.2 乙醇洗杂对ALA粗品纯度的影响
• 6.3.3.3 有机溶剂沉淀实验
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢