CP5型金黄色葡萄球菌荚膜多糖的提取纯化与鉴定

论文摘要

目的:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是奶牛乳房炎的主要致病菌,其主要致病因子之一是其细胞壁外面的一层保护膜——荚膜多糖（capsularpolysaccharide,CP）。研究发现,CP5型和CP8型金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎主要致病菌株,因此,本实验选取荚膜多糖5型金黄色葡萄球菌,通过细菌培养,提取、纯化和鉴定其荚膜多糖,为进一步了解荚膜多糖在细菌生物学上的作用和免疫学用途做准备。方法:细菌在50个哥伦比亚血琼脂基础培养基平板上24h培养后用磷酸缓冲液生理盐水收集。菌液经121℃,1h高温高压处理后25,000×g离心沉淀,收集上清液。无水乙醇30%（V/V）4℃过夜,离心去除沉淀。上清液加入核糖核酸酶A和脱氧核糖核酸酶Ⅰ,37℃过夜,链霉蛋白酶和蛋白酶K 37℃过夜。12～14KDa截留分子量透析袋三蒸水透析。无水乙醇80%（V/V）4℃过夜,离心收集沉淀,得有粘稠感白色粗荚膜多糖。加入PBS,溶解粗提物,高碘酸钠黑暗处常温处理,用25%（V/V）乙二醇终止反应,三蒸水透析。超滤离心管去除大于100KDa和小于50KDa物质。30KDa和10KDa超滤管浓缩样品,葡聚糖纤维纯化荚膜多糖,紫外光分光光度计490nm检测,含多糖样品低压冻干保存。结果:苯酚-硫酸法测定粗制荚膜多糖样品含糖量为:26.15μg/ml,即29.88%;核酸蛋白仪测定核酸含量为0.1113 mg/ml,蛋白质含量为0.0103 mg/ml;高效液相色谱鉴定样品多糖的单糖主要组成成分为:甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸,葡萄糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖。结论:经高效液相色谱对荚膜多糖样品进行单糖组成分析和600兆高灵敏度核磁共振氢谱一级结构分析,样品基本上与国外研究相符合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 引言
• 1 奶牛乳腺炎发病率高、危害大
• 2 奶牛乳房炎的致病因素和主要病原微生物
• 3 奶牛乳房炎传统治疗方法及其局限性
• 4 奶牛乳房炎治疗研究新趋势
• 文献综述
• 1 金黄色葡萄球菌研究进展
• 1.1 金黄色葡萄球菌
• 1.2 金黄色葡萄球菌抵抗力及流行现状
• 1.3 金黄色葡萄球菌抗原结构、代谢产物及其生化特征
• 1.4 金黄色葡萄球菌的分型
• 2 金黄色葡萄球菌荚膜多糖研究进展
• 2.1 金黄色葡萄球菌荚膜多糖生物化学
• 2.2 金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清5和8型的基因型研究
• 2.3 金黄色葡萄球菌主要致病荚膜多糖血清型
• 2.4 金黄色葡萄球菌荚膜多糖与致病力的关系
• 2.5 血液中的金黄色葡萄球菌荚膜多糖研究
• 3 金黄色葡萄球菌荚膜多糖致病机制研究
• 3.1 金黄色葡萄球菌CP1型和CP2型致病机制研究
• 3.2 金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的吞噬杀伤作用
• 4 金黄色葡萄球菌荚膜多糖抗原及其免疫原性研究
• 5 金黄色葡萄球菌荚膜多糖产量的影响因素分析进展
• 6 荚膜多糖提取、纯化及其鉴定方法研究进展
• 6.1 多糖的提取方法
• 6.1.1 多糖的常规提取方法
• 6.1.2 物理辅助提取
• 6.1.3 超临界流体萃取
• 6.2 多糖的脱色研究
• 6.3 多糖的纯化研究
• 6.3.1 化学试剂除杂
• 6.3.2 膜分离
• 6.4 金黄色葡萄球菌荚膜多糖鉴定方法研究
• 7 目的和意义
• 试验一 金黄色葡萄球菌的培养
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 细菌接种培养
• 2.2 荚膜染色原理和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 试验二 金黄色葡萄球菌荚膜多糖的粗提
• 1 材料
• 2 方法与步骤
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 样品预处理
• 4.2 多糖样品在醇沉时的乙醇浓度
• 4.3 多糖样品醇沉时间
• 5 小结
• 试验三 荚膜多糖粗提物含糖量含量测定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 试验四 金黄色葡萄球菌荚膜多糖的纯化
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 蛋白质和核酸的去除
• 2.2 去磷壁酸
• 2.3 离心超滤管除杂和浓缩
• 2.4 荚膜多糖过葡聚糖纤维素过柱纯化
• 3 结果
• 4 讨论
• 试验五 荚膜多糖的高效液相色谱鉴定
• 1 材料
• 2 方法（略）
• 3 结果
• 3.1 峰所对应的单糖名称
• 3.2 空白对照图
• 4 讨论
• 5 小结
• 试验六 核磁共振鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 1 细菌的培养
• 2 多糖的醇沉及除杂
• 3 提取多糖时缓冲液环境
• 4 多糖纯化的特殊性
• 5 离心超滤管的运用
• 6 多糖的脱色
• 7 荚膜多糖杂质问题
• 8 多糖的检测
• 9 荚膜多糖的鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 附录