苏云金芽胞杆菌Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白纯化

论文摘要

金龟子属于鞘翅目金龟总科（Scarabaeoidae），其幼虫（俗称蛴螬）是一类重要的世界性分布的地下害虫，可危害多种农林植物。20年来全国各地的大量调查表明，蛴螬在地下害虫中危害居首位。本文围绕对鞘翅目暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）铜绿丽金龟（Anomala carpulenta）的幼虫有活性的苏云金芽孢杆菌Cry8Ea1和Cry8Ca2蛋白的表达和纯化进行了研究。HD8E和HBF-1菌株是苏云金芽孢杆菌的菌株，分别含有cry8Ea1和cry8Ca2的基因，编码Cry8Ea1和Cry8Ca2的原毒素（伴孢晶体）。研究表明，两个菌株表达的伴孢晶体均为球形晶体，相对分子质量为130kU。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化得到60kU的活性毒素，利用分子筛层析（Superdex200）收集60kU的毒素，然后使用阴离子交换层析进一步纯化得到纯的60kU的毒素。对纯蛋白进行生物活性测定，结果表明Cry8Ea1的原毒素与毒素对暗黑鳃金龟幼虫均具有较高活性，Cry8Ea1原毒素的LC50值为9.47μg／克土，胰凝乳蛋白酶消化后纯化的毒素的LC50值为35.39μg／克土；Cry8Ca2的原毒素和毒素对铜绿丽金龟幼虫也具有很高的活性，Cry8Ca2原毒素的LC50值为0.47μg／克土，胰凝乳蛋白酶消化后纯化的毒素的LC50值为0.08μg／克土，胰蛋白酶消化后纯化的毒素的LC50值为0.003μg／克土。本研究建立了Cry8Ea1与Cry8Ca2活性毒素蛋白的纯化方法，通过该方法可大量获得该毒素的纯品，为进一步研究该蛋白的结构与功能，揭示毒素的杀虫机理奠定了良好的基础。研究中还发现Cry8Ea1和Cry8Ca2蛋白是与DNA相结合的。在本实验中对DNA的作用进行了研究，用透析的方法分别对两种毒素的DNA复合体和去除了DNA的毒素在不同pH条件及不同缓冲液条件下的稳定性进行了比较，结果表明，Cry8Ea1和Cry8Ca2毒素与DNA的复合体的稳定性要比不含DNA的毒素稳定，不易发生沉淀，DNA在维持毒素稳定性中起到重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 杀虫晶体蛋白
• 1.1.1 杀虫晶体蛋白的类型
• 1.1.2 ICPs的杀虫作用机理
• 1.2 BT杀虫晶体蛋白晶体解析情况及功能研究
• 1.2.1 Bt杀虫晶体蛋白晶体解析情况
• 1.2.2 解析的晶体蛋白结构的比较
• 1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白与受体结合
• 1.2.4 三个结构域的Loop及残基与杀虫活性的关系
• 1.2.5 与通道形成相关的作用机制研究进展
• 1.3 地下害虫蛴螬及对其有活性的BT CRY8类基因研究进展
• 1.4 蛋白纯化方法
• 1.4.1 分子筛层析
• 1.4.2 离子交换层析
• 1.4.3 亲和层析
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.2 方法
• 2.2.1 cry8Ea1与cry8Ca2基因的亚克隆
• 2.2.1.1 引物设计
• 2.2.1.2 模板制备
• 2.2.1.3 PCR反应
• 2.2.1.4 酶切分析
• 2.2.1.5 E.coli质粒DNA提取
• 2.2.1.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.1.7 DNA回收
• 2.2.1.8 连接反应
• 2.2.1.9 感受态细胞制备
• 2.2.1.10 E.coli的转化
• 2.2.1.11 基因在大肠杆菌中诱导表达
• 2.2.1.12 序列测定及分析
• 2.2.1.13 SDS-PAGE电泳
• 2.2.2 Cry8Ea1与Cry8Ca2原毒素的表达与纯化
• 2.2.2.1 Cry8Ea1与Cry8Ca2原毒素的表达
• 2.2.2.2 Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白提取
• 2.2.2.3 Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白的纯化
• 2.2.3 杀虫测定
• 2.2.4 数据分析处理
• 3 实验结果
• 3.1 cry8Ea1与cry8Ca2活性区基因亚克隆及在大肠杆菌中表达
• 3.2 含有cry8Ea1与cry8Ca2基因Bt菌株的表达与纯化
• 3.2.1 菌体形态特征观察
• 3.2.2 Cry8Ea1与Cry8Ca2菌株的表达
• 3.2.3 Cry8Ea1蛋白的纯化
• 3.2.3.1 Cry8Ea1原毒素胰蛋白酶消化条件的摸索
• 3.2.3.2 Cry8Ea1原毒素胰蛋白酶消化后过分子筛
• 3.2.3.3 Cry8Ea1蛋白胰凝乳蛋白酶消化条件摸索
• 3.2.3.4 Cry8Ea1蛋白胰凝乳蛋白酶消化后过分子筛层析
• 3.2.3.5 阴离子交换层析
• 3.2.3.6 Cry8Ea1蛋白活性区三维结构模拟
• 3.2.4 Cry8Ca2消化毒素的分离纯化
• 3.2.4.1 Cry8Ca2原毒素胰凝乳蛋白酶消化条件摸索
• 3.2.4.2 分子筛层析
• 3.2.4.3 阴离子交换层析
• 3.3 Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋自生物活性的测定
• 3.3.1 Cry8Ea1蛋白生物活性的测定
• 3.3.2 Cry8Ca2蛋白生物活性的测定
• 3.3.3 Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白稳定性实验
• 3.3.4 Cry8Ca2毒素盐酸胍变性研究
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录A:缩略语中英文注释
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文