白蛋白纳米粒作为疏水性和亲水性药物的载体研究

论文摘要

纳米给药系统是纳米技术在药剂学领域的应用成果,也是目前研究的热点之一,通常其给药方式以静脉注射为主。目前常用的载体有聚乳酸（PLA）、乳酸-羟基乙醇酸共聚物（PLGA）、聚己内酯（PCL）、壳聚糖等,尽管都属于生物可降解材料,但有些材料的安全性还待于进一步评价。人血清白蛋白（human serumalbumin,HSA）是一种天然血液制品,具有无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点,是一种理想的静脉注射用的药物载体材料。因此,对以白蛋白为载体的纳米给药系统研究具有重要现实意义。本文主要针对白蛋白纳米粒作为疏水性药物、亲水性药物的载体系统,及其赋予其主动脑靶向功能等三方面问题开展研究。第一方面,选择抗真菌药物—伊曲康唑作为模型难溶性药物,进行了伊曲康唑白蛋白纳米粒（ITZ-NPs）的研究。通过考察蛋白结合技术的制备工艺、白蛋白浓度、有机溶剂含量、药物浓度的影响,并采用星点设计进行处方优化,获得优化处方:白蛋白浓度为1%,药物浓度为50mg/mL,有机相体积比为4%。制备的ITZ-NPs平均粒径约100nm,载药量大于10%。红外（IR）、差示扫描量热、X射线粉末衍射（XRD）显示,伊曲康唑在纳米粒中以分子与白蛋白复合形式存在。为蛋白结合技术包载难溶性药物的研究奠定了基础。体外抗白色念珠菌活性显示,ITZ-NPs显著提高了伊曲康唑的抗真菌活性,ITZ-NPs的MIC50（0.125μg/mL）为伊曲康唑的1/2。毒性考察结果表明,ITZ-NPs体外溶血程度低;ITZ-NPs在小鼠体内的最大无作用量（160mg/kg）为伊曲康唑环糊精制剂（ITZ-CD）4倍,提示以白蛋白纳米粒为药物载体的ITZ-NPs安全性良好。ITZ-NPs血药动力学特征与ITZ-CD相似,但明显提高了伊曲康唑在肝、脾和肺组织中的分布,肺组织高分布有利于提高其对肺部真菌感染的治疗效果。提示ITZ-NPs是一种具有良好前景的抗真菌白蛋白纳米给药系统。第二方面,采用狂犬病毒糖蛋白29肽段（RVG）修饰ITZ-NPs,设计了一种可主动脑靶向的白蛋白纳米给药系统。采用链霉亲和素将生物素化的脑靶向配体（RVG）与伊曲康唑白蛋白纳米粒桥联RVG-ITZ-NPs,其粒径约90nm、Zeta电位-33mV。大鼠药动学结果表明,RVG-ITZ-NPs药动学参数与和ITZ-NPs、ITZ-CD均无显著性差异。大鼠脑毛细血管内皮细胞（BCEC）和小鼠体内荧光示踪和流式细胞检测结果表明,10和200ng/mL的RVG能够携带ITZ-NPs导入BCEC细胞和靶向脑组织,10ng/mL的RVG将BCEC细胞对纳米粒的摄取能力提高了8倍左右。小鼠组织分布中,RVG-ITZ-NPs伊曲康唑在脑、肺和肝组织的分布均明显高于ITZ-CD和ITZ-NPs。表明RVG-ITZ-NPs能跨越血脑屏障靶向至脑组织,提示RVG是一种良好的脑靶向配体,可为提高伊曲康唑脑内浓度提供新的靶向载体系统。第三方面,选取抗胰腺癌的一线药物—吉西他滨作为模型亲水性药物,开展了吉西他滨白蛋白纳米粒研制工作。采用去溶剂法结合戊二醛交联技术制各白蛋白纳米粒。考察了各种影响因素,选取白蛋白浓度、药物和戊二醛用量作为重要影响因素,制备了两种粒径（110nm和400nm）的吉西他滨白蛋白纳米粒,体外持续释药达6-12h。大鼠体内动力学研究显示,两种粒径纳米粒均未改变吉西他滨的血药动力学特征。组织分布显示,400nm吉西他滨白蛋白纳米粒具有较高的胰腺和肝脏分布。荷瘤鼠抗肿瘤活性结果标明,两种粒径纳米粒有明显抑制胰腺癌转移的作用,且400nm吉西他滨白蛋白纳米粒的抗肿瘤瘤效果显著优于110nm纳米粒和吉西他滨。此研究结果对白蛋白纳米粒包载水溶性药物具有一定指导意义,并提供了一种低毒有效的吉西他滨纳米给药系统。

论文目录

中文摘要

ABSTRACT

前言

一研究背景

二、研究内容

三、研究意义

参考文献

第一部分伊曲康唑白蛋白纳米粒的研究

第一章伊曲康唑白蛋白纳米粒的制备

1、仪器和材料

2、方法和结果

2.1 伊曲康唑分析方法建立

2.1.1 定量方法和标准曲线的建立

2.1.2 定量方法考察

2.2 伊曲康唑纳米粒（IIT-NPs）制备工艺和评价方法

2.2.1 IIT-NPs的初步制备工艺

2.2.2 IIT-NPs的粒径和zeta电位的测定

2.2.3 载药量和包封率的测定

2.3 制备工艺影响因素考察

2.3.1 均质次数和压力的影响

2.3.2 药物浓度的影响

2.3.3 HSA浓度的影响

2.3.4 有机相体积百分比的影响

2.4 处方优化

2.4.1 优化设计

2.4.2 模型拟合及预测

2.4.3 优化处方的验证

3、讨论

本章小结

参考文献

第二章伊曲康唑白蛋白纳米粒的体外评价

1、材料与仪器

2、方法与结果

2.1 伊曲康唑纳米粒的性质研究

2.1.1 透射电镜

2.1.2 红外光谱

2.1.3 差示扫描量热

2.1.4 X-射线粉末衍射

2.2 体外释放

2.3 体外稳定性考察

2.3.1 稀释稳定性

2.3.2 放置稳定性

2.4 体外溶血性考察

2.5 体外抗真菌活性的考察

2.5.1 药液的配置

2.5.2 药敏评价

3、讨论

本章小结

参考文献

第三章伊曲康唑白蛋白纳米粒的体内评价

1、材料与试剂

2、方法与结果

2.1 体内样品分析方法建立

2.1.1 药物及其代谢产物

2.1.2 生物样品预处理

2.1.3 色谱条件

2.1.4 方法专属性

2.1.5 标准曲线建立

2.1.5 精密度试验

2.1.7 稳定性考察

2.2 ITZ-NPs药动学与组织分布试验

2.2.1 标准曲线建立

2.2.2 大鼠血药动力学

2.2.2.1 实验方案

2.2.2.2 数据处理及结果

2.2.3 小鼠血药与组织药物动力学

2.2.3.1 实验方案

2.2.3.2 血药动力学数据处理及结果

2.2.3.3 药物组织分布与动力学数据处理及结果

2.2.3.4 组织中AUC比较

2.3 ITZ-NPs体内毒性考察

3、讨论

本章小结

参考文献

第四章脑靶向伊曲康唑白蛋白纳米粒的研究

1、材料与仪器

2、方法与结果

2.1 生物素化材料制备

2.1.1 生物素活泼酯制备

2.1.2 生物素化RVG肽（Bio-RVG）制备

2.1.3 生物素化人血清白蛋白（Bio-HSA）制备

2.2 脑靶向伊曲康唑白蛋白纳米粒（RVG-ITZ-NPs）制备

2.2.1 生物素化伊曲康唑白蛋白纳米粒（Bio-ITZ-NPs）制备

2.2.2 RVG-ITZ-NPs制备

2.3 荧光标记纳米粒

2.3.1 荧光标记白蛋白（HSA-FITC）

2.3.2 荧光标记生物素化白蛋白（Bio-HSA-FITC）

2.3.3 荧光标记ITZ-NPs（ITZ-NPs-FITC）

2.3.4 荧光标记Bio-ITZ-NPs（Bio-ITZ-NPs-FITC）

2.3.5 荧光标记RVG-ITZ-NPs（RVG-ITZ-NPs-FITC）

2.4 纳米粒表征

2.4.1 粒径和zeta电位测定

2.4.2 载药量与包封率的测定

2.4.3 体外释放考察

2.5 RVG-ITZ-NPs体外靶向性考察

2.5.1 荧光显微镜观察

2.5.2 流式细胞仪检测

2.6 RVG-ITZ-NPs脑组织摄取

2.7 大鼠血药动力学研究

2.7.1 实验方案

2.7.2 数据处理及结果

2.8 RVG-ITZ-NPs组织分布

2.8.1 试验方案

2.8.2 数据处理及结果

3、讨论

本章小结

参考文献

第二部分吉西他滨白蛋白纳米粒的研究

第五章吉西他滨白蛋白纳米给药系统的制备

1、材料与试剂

2、方法与结果

2.1 吉西他滨定量方法的建立

2.1.1 色谱条件

2.1.2 标准曲线的建立

2.1.3 方法学考察

2.2 吉西他滨基本性质的表征

2.2.1 吉西他滨制备

2.2.2 溶解度与分配系数测定

2.3 吉西他滨白蛋白纳米粒的表征方法

2.3.1 粒径和Zeta电位测定

2.3.2 载药量和包封率测定

2.3.3 释放度考察

2.4 制备工艺的选择

2.4.1 空白纳米粒制备工艺

2.4.2 pH选择

2.4.3 非溶剂选择

2.4.4 乙醇用量

2.4.5 乙醇加入速度

2.4.6 交联时间

2.4.7 载药工艺

2.4.7.1 吸附载药法

2.4.7.2 直接载药法

2.4.7.3 吸附载药与直接载药结合

2.4.7.4 载药工艺的比较

2.4.8 制备工艺确定

2.5 单因素考察

2.5.1 白蛋白浓度的影响

2.5.2 投药量的影响

2.5.3 交联剂用量的影响

2.6.处方优化

2.7 优化处方验证

2.7.1 100nm纳米粒的制备

2.7.2 300-400nm纳米粒的制备

2.7.3 载药纳米粒表征

3、讨论

本章小结

参考文献

第六章吉西他滨白蛋白纳米粒的体内外生物学评价

1、材料与仪器

2、方法与结果

2.1 生物样品定量方法的建立[1]

2.1.1 生物样品的处理

2.1.2 高效液相色谱条件

2.1.3 标准曲线的建立和方法学考察

2.2 体内药动学与组织分布

2.2.1 大鼠体内药动学结果

2.2.2 大鼠组织分布结果

2.3 抗肿瘤药效学试验

2.3.1 细胞毒性（MTT）试验

2.3.2 动物试验

2.3.2.1 动物体重变化

2.3.2.2 肿瘤抑制效果

2.3.2.3 肿瘤形态和转移观察

3、讨论

本章小结

参考文献

总结

英文缩略语注释

Curriculum Vitae

致谢

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