论文摘要
目的:1.构建携带IL-24基因片段的重组复制缺陷型腺病毒Ad-IL-24,为探讨治疗胰腺癌的方法提供实验基础。2.观察重组腺病毒介导的IL-24基因对人胰腺癌细胞patu8988生长的抑制作用,探讨IL-24抑制胰腺肿瘤生长的机理。3.研究重组腺病毒介导的IL-24基因对小鼠髓系树突状细胞成熟活化的影响,探讨IL-24基因在肿瘤免疫治疗中的作用。4.观察重组腺病毒介导的IL-24基因对裸鼠体内胰腺肿瘤生长的抑制作用,探讨IL-24对胰腺癌的治疗潜力。方法:从Genbank中查得IL-24基因cDNA全长序列,选择5’端转录起始位点附近长621bp的基因序列为目的基因片段,设计特异性克隆引物。从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取总RNA,以总RNA为模板用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR ）扩增IL-24基因片段。将经基因测序证实为正确的基因片段反向克隆到重组腺病毒载体AdEasy系统中的穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆位点（multiple cloning site,MCS ）,构建携带IL-24基因片段的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-IL-24;再将pAdTrack-CMV-IL-24与重组腺病毒载体AdEasy系统中的骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌DH5a内进行同源重组,经293细胞包装生成携带IL-24基因片段的重组腺病毒Ad-IL-24,同时构建空病毒Ad-GFP。通过在荧光显微镜下观察发绿色荧光数检测绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）的表达,测定Ad-IL-24和Ad-GFP的滴度。用感染复数（multiplicities of infection,MOI）为100的Ad-IL-24感染人胰腺癌细胞株patu8988,用Western blot、ELISA检测细胞培养液中IL-24的蛋白表达;用MTT法、流式细胞术（FCM）分别检测Ad-IL-24对人胰腺癌细胞株patu8988生长情况的影响。采用小鼠髓系树突状细胞（BMDCs）开展研究,从小鼠骨髓中获取和培养未成熟树突状细胞（dendritic cells,DC）,通过FCM、ELISA法检测DC经IL-24转染后表型和功能状态的变化,研究IL-24促进DC成熟活化的作用。裸鼠成瘤实验,观察人胰腺癌patu8988细胞的成瘤情况及IL-24对裸鼠体内胰腺肿瘤的治疗作用;通过免疫组化检测肿瘤组织中微血管密度MVD、VEGF、MMP-2的表达。结果:1.成功的从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取并扩增出621bp的IL-24基因片段,经DNA测序证实该基因片段序列与Genbank中IL-24基因cDNA序列5’端转录起始位点附近621bp的基因序列完全一致。2.成功地构建出携带IL-24基因片段的重组腺病毒Ad-IL-24,病毒滴度>5×1010pfu/ml。3.Ad-IL-24感染的patu8988细胞增殖能力降低,凋亡率明显升高。4.IL-24刺激BMDCs 48h后,细胞表现出成熟DCs的表型和功能特征,即共刺激分子CD40, CD80, CD86上调表达;并能有效拮抗负性调控因子IL-10下调DCs上CD40、CD80、CD86表达的作用,细胞培养液中IL-12、TNF-α的表达水平升高。5.瘤内注射Ad-IL-24后胰腺肿瘤瘤体生长减慢,肿瘤内微血管密度MVD、VEGF、MMP-2较对照组明显减少,荷瘤裸鼠的生存期明显延长。结论:1.重组腺病毒介导的IL-24基因可明显抑制胰腺癌细胞的生长、促进胰腺癌细胞凋亡。2.重组腺病毒介导的IL-24基因可促进树突状细胞的活化及功能成熟。3.重组腺病毒介导的IL-24基因能抑制胰腺肿瘤血管生成,延长荷瘤裸鼠的生存期。