先天性心脏病间隔缺损GATA-4基因突变及功能分析

论文摘要

先天性心脏病（Congential heart disease,CHD）是最常见的人类出生缺陷,同时也是儿童非感染性疾病的主要死亡原因,发生率占活产婴儿的4‰～50‰。我国每年至少有15万CHD患儿出生,严重危害着婴幼儿的健康。CHD是一种复杂的心血管系统发育异常性疾病,主要是由遗传因素和环境因素共同作用所致。其中遗传因素在CHD的发病过程中发挥着重要作用,遗传率为55%～65%。因其遗传方式、外显率等均不清楚,所以CHD致病基因尚未确定。近十年来随着分子生物学和分子遗传学技术的进展,人们对心脏发育的过程及其机制有了更深入的了解。心脏发育不仅涉及不同时间、不同空间若干基因的先后表达,也涉及这些基因间复杂而精确的相互作用,其中任何一个基因表达质或量的异常都可能会影响心脏发育而导致CHD。当今心脏特异性转录因子成为研究热点,大量实验研究发现转录因子GATA-4、TBX5、ZIC3、NKX2.5、TFAP2B、TBX1和FOG2与CHD发生密切相关,其中NKX2.5、TBX5和GATA-4与心脏间隔形成相关。GATA-4是近年来新发现的,在心脏发育过程中起重要作用的一个基因。人类GATA-4基因定位于8p23.1-p22,全长50kbp,包含7个外显子,编码442个氨基酸。GATA-4是心脏前体细胞最早期标志之一。实验研究表明GATA-4基因如同其他转录因子NKX2.5、MYH6和NOTCH1等,其突变可以引起非综合征CHD,如房室间隔缺损（Atrioventricular septal defect,AVSD）、房间隔缺损（Atrial septal defect,ASD）、室间隔缺损（Ventricular septal defect,VSD）、动脉导管未闭（Patent ductus ateriosus,PDA）、法洛氏四联症（Tetralogy of Fallot,TOF）、肺动脉狭窄（Pulmonary stenosis,PS）、右心室发育不良（Hypoplastic right ventricle, HRV）和部分肺静脉异位引流（Partial anomalous pulmonary venous connection,PAPVC）等。但迄今GATA-4基因突变所对应的CHD表现型还不确定,GATA-4及其他转录因子与心脏发育基因之间的相互关系,转录因子之间的协调作用以及影响心脏发育的机制尚不明确,均需要进一步研究。本文旨在探讨先天性心脏间隔缺损（Cardiac septal defects,CSD）中转录因子GATA-4基因突变情况以及GATA-4基因突变对心脏间隔形成的影响。将为CHD的早期诊断和治疗探索出新的途径。第一部分先天性心脏病间隔缺损GATA-4基因的突变分析目的:探讨先天性房、室间隔缺损患者GATA-4基因突变情况以及其基因型和表现型之间的关系。方法:选择50例汉族先天性房、室间隔缺损患者和100例汉族健康者,应用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）方法扩增GATA-4基因6个外显子编码区及两侧各50个碱基以上的序列,PCR产物纯化后经ABI PRISM 3730全自动DNA测序仪自动测序,然后与NCBI数据库中GATA-4基因的序列进行比对,并与健康对照组比较,观察GATA-4基因突变情况;利用生物信息学方法预测GATA-4基因点突变对其蛋白结构和功能影响。结果:1.找到GATA-4基因三个多态性位点。除了在第2号外显子上第196位核苷酸发现存在G→A转换（c.G196A）,导致相应的第66位的丙氨酸（Ala）被苏氨酸（Thr）取代（Ala66Thr）,而SNP库报道rs1139244第196位核苷酸G→C颠换（c.G196C）,导致相应的第66位的丙氨酸（Ala）被脯氨酸（Pro）取代（Ala66Pro）以外,rs1062215和rs804280二个多态性位点基因型与NCBI的SNP数据库中报道的完全一致。2.发现GATA-4基因两个新的杂合子突变,分别位于第2号外显子的His28Tyr和位于第7号外显子的His436Tyr,在NCBI的SNP数据库中均未见报道且在100例对照组中也未发现。3. GATA-4基因编码第28位和第436位组氨酸在生物进化过程中均处于高度保守。4. SIFT和PolyPhen程序预测GATA-4基因His28Tyr和His436Tyr两个点突变都可能影响它的蛋白质功能。结论:转录因子GATA-4基因突变可能与汉族先天性房、室间隔缺损发生有关。第二部分先天性心脏病间隔缺损突变的GATA-4基因功能初步分析目的:初步研究汉族先天性房、室间隔缺损患者GATA-4基因两个突变点的功能。方法:以野生型pcDNA3.1-GATA-4为模板,用基因定点突变的方法构建突变型真核表达载体;在体外和ANF luciferase报告质粒共转染Hela细胞,48小时后检测下游ANF-Luciferase报告基因的活性。结果:1. PcDNA3.1-GATA-4突变型真核表达质粒经正反两个方向进行测序验证构建成功。2. GATA-4基因His28Tyr突变型质粒激活下游ANF luciferase报告基因的活性与野生型GATA-4质粒相比是（112±6.9）% ,没有显著性差异（P > 0.05）;而GATA-4基因His436Tyr突变型质粒激活下游ANF luciferase报告基因的活性明显下降,与野生型GATA-4质粒相比是（53.8±6.6）%,具有显著性差异（P < 0.01）。结论:1. PcDNA3.1-GATA-4突变型真核表达质粒成功构建。2. GATA-4基因His28Tyr杂合子突变不影响下游靶基因的转录活性;而GATA-4基因His436Tyr杂合子突变明显降低了下游靶基因的转录活性,提示His436Tyr杂合子突变影响了GATA-4基因蛋白质生物功能。

论文目录

• 主要英文缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 先天性心脏病间隔缺损 GATA-4 基因的突变分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 先天性心脏病间隔缺损突变的 GATA-4 基因功能初步分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文小结
• 创新点
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢