鸭肝炎病毒的纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（DHV,duck hepatitis virus）引起的主要发生于3周龄以下雏鸭的一种传播迅速、高度致死性的传染病。本试验主要对鸭肝炎病毒进行增殖、鉴定和纯化,利用纯化的病毒作为抗原免疫小鼠并建立了间接ELISA筛选方法,并经过一系列的融合筛选成功制备了抗鸭病毒性肝炎的单克隆抗体,从而为实验室建立DVH的快速诊断方法及今后对DHV的研究奠定基础。本试验用鸭胚进行DHV增殖,运用Reed-Muench法测定DELD50为10-7.12,0.2mL;鸭胚中和试验鉴定此DHV为Ⅰ型鸭肝炎病毒;通过氯仿去脂、PEG反透析、DEAE52纤维素层析和超高速离心的纯化方法对病毒进行了纯化。纯化后的病毒经负染在电镜下观察可看到圆形、大小均一、直径约为15nm左右的病毒粒子。用纯化的病毒液接种雏鸭,进行回归试验,可以引起雏鸭“角弓反张”的典型症状与肝脏出血等病理变化。用纯化的病毒作为抗原来免疫BALB/c小鼠后建立间接ELISA筛选方法。细胞融合前经反复试验,确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,即:抗原包被浓度为50μg/mL,以1:5000稀释的阴、阳性血清分别作为阴、阳性对照,反应条件均以37℃50min为佳,酶标二抗的工作浓度为1:6000。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选出3株阳性杂交瘤细胞株,将获得的阳性细胞株用有限稀释法进行3次亚克隆,筛选出2株能稳定分泌McAb的细胞株,分别命名为1D10和586。对这2株杂交瘤细胞株的稳定性、染色体、亚类、抗原表位特异性、亲和力、腹水效价、特异性进行了鉴定,结果如下:在经过3个月的连续传代和3个月后的复苏检测,其分泌抗体的能力差异不显著,表明其稳定性好;染色体数目平均在84—92条之间;经亚类鉴定,2株杂交瘤细胞分泌的抗体类型均为IgG1亚类,轻链类型均为k链;经抗原表位特异性分析,2株单克隆抗体的识别表位相同或相近;其相对亲和力的测定结果是1D10＞586;抗体效价为1D10＞586,其中1D10株杂交瘤细胞的腹水效价达1:409 600;经过ELISA方法检测2株DHV单克隆抗体与鸭瘟无任何交叉反应,特异性较好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 前言
• 1 病原特性
• 2 临床症状与病理变化
• 3 鸭病毒性肝炎的诊断
• 3.1 临床症状及病理特征
• 3.2 病毒的分离
• 3.3 病毒中和试验（Virus-neutralization test,VN）
• 3.4 电镜检测
• 3.5 荧光抗体技术
• 3.6 酶联免疫吸附试验
• 3.7 其他血清学方法
• 3.8 免疫胶体金诊断技术
• 3.9 分子生物学诊断技术
• 4 鸭肝炎病毒的纯化
• 5 单克隆抗体技术在DHV检测方面优势及应用
• 6 目的意义
• 试验一 DHV抗原的鉴定与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株
• 1.1.2 DHV阳性血清
• 1.1.3 试验鸭胚、动物
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒的增殖
• 50)的测定（殷震,2003）'>1.2.2 鸭胚半数致死量(DELD₅₀)的测定（殷震,2003）
• 1.2.3 鸭胚中和试验
• 1.2.4 DHV的纯化
• 1.2.5 雏鸭回归试验
• 2 结果
• 2.1 DHV的攻毒结果
• 50)'>2.2 鸭胚半数致死量(DELD₅₀)
• 2.3 鸭胚中和试验结果
• 2.4 病毒纯化结果
• 2.4.1 尿囊液初步纯化后结果
• 52纤维素层析柱层析'>2.4.2 DEAE₅₂纤维素层析柱层析
• 2.4.3 电镜观察结果
• 2.4.4 雏鸭回归试验结果
• 3 讨论
• 3.1 鸭肝炎病毒的增殖
• 3.2 鸭肝炎病毒的纯化
• 试验二 DHV单克隆抗体的制备
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 抗原、试验动物及细胞
• 1.4 主要溶液及其配制
• 1.5 BALB/c小鼠的免疫
• 1.6 间接ELISA方法的建立
• 1.6.1 抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度的确定
• 1.6.2 最佳包被条件的确定
• 1.6.3 最佳一抗反应时间的确定
• 1.6.4 最佳酶标二抗反应时间的确定
• 1.7 细胞融合
• 1.7.1 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
• 1.7.2 饲养细胞的制备
• 1.7.3 免疫脾细胞的制备
• 1.7.4 免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合
• 1.7.5 阳性孔的筛选（双筛）
• 1.7.6 杂交瘤阳性细胞的克隆化
• 1.7.7 单克隆抗体的制备及纯化
• 1.8 单克隆抗体的鉴定
• 1.8.1 杂交瘤细胞染色体数的检测
• 1.8.2 单克隆抗体亚型的鉴定
• 1.8.3 单克隆抗体纯化效果的检测
• 1.8.4 单克隆抗体效价的测定
• 1.8.5 单克隆抗体的特异性鉴定
• 1.8.6 单克隆抗体的表位特异性检测
• 1.8.7 单克隆抗体相对亲和力的测定
• 1.8.8 杂交瘤细胞的冻存复苏
• 1.8.9 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 间接ELISA方法的建立
• 2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 2.3 McAb的纯化效果检测
• 2.4 杂交瘤细胞染色体数的结果分析
• 2.5 McAb的亚类鉴定
• 2.6 细胞培养液上清及腹水效价
• 2.7 McAb特异性鉴定结果
• 2.8 McAb的表位特异性检测
• 2.9 McAb的相对亲和力
• 2.10 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性测定
• 3 讨论
• 3.1 动物免疫
• 3.2 细胞融合过程中应注意的几个问题
• 3.3 杂交瘤细胞株的筛选
• 3.4 杂交瘤细胞克隆化培养的讨论
• 3.5 细胞冻存
• 3.6 腹水的制备
• 3.7 单克隆抗体的纯化
• 3.8 关于在杂交瘤细胞制备过程中污染问题
• 3.9 关于单克隆抗体进行鉴定
• 结论
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文和参编的书籍
• 致谢