rAAV2/1-Acrp30对GK大鼠大血管病变的影响及机理研究

论文摘要

第一部分rAAV2/1-Acrp30病毒的获得与纯化目的:将大鼠脂联素（Acrp30）基因克隆到腺相关病毒（AAV）载体中,经包装、纯化后获得rAAV2/1-Acrp30病毒。方法:根据GenBank基因序列NM 144744,设计相应特异性引物,上游引入EcoRⅠ位点,下游引入SalⅠ位点,从脂肪组织中抽取总RNA,使用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA后,以cDNA为模板进行RT-PCR后,扩增Acrp30目的基因。使用EcoRⅠ与SalⅠ酶切病毒载体质粒pSNAV,回收酶切后的载体片段和PCR产物,T4 DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-Acrp30,EcoRⅠ/Sal双酶切鉴定,并行测序。转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△ML2感染,包装此细胞株并收获病毒载体rAAV2/1-Acrp30。行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果:①PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的Acrp30基因正确。②rAAV2/1-Acrp30病毒的大致滴度为1.0×1012μg/ml,分泌蛋白浓度为50ng/ml,重组AAV2/1病毒纯度很高。结论:实验获得的脂联素病毒载体滴度高、感染性好,可以满足GK大鼠脂联素基因治疗的实验研究需要。第二部分rAAV2/1-Acrp30在大鼠体内表达的比较研究目的:观察通过不同途径、不同剂量注射脂联素重组腺相关病毒（rAAV2/1-Acrp30）在大鼠体内表达效率的比较研究。方法:分别将3种剂量rAAV2/1-Acrp30通过皮下注射、腹腔注射、肌肉注射2月龄Wistar大鼠。21天后,处死动物,取主动脉、肌肉、肝脏、脂肪组织及血清,通过酶联免疫吸附试验和原位杂交比较不同途径、不同剂量方法,血清脂联素及主动脉、肌肉、肝脏、脂肪组织局部的脂联素表达差异,确定脂联素基因治疗的最佳途径和剂量。结果:皮下注射、腹腔注射rAAV2/1-Acrp30与肌肉注射rAAV2/1-Acrp30相比,脂联素基因在主动脉、肌肉、肝脏的表达明显低于肌肉注射的对照组（P＜0.05）,并与rAAV2/1-Acrp30呈剂量-浓度依赖性,但在不同途径、不同剂量注射rAAV2/1-Acrp30,血清脂联素无变化（P＞0.05）。结论:肌肉注射rAAV1-Acrp30可能是脂联素基因治疗最佳途径,1×1011v.g/ml或以上可能是脂联素基因治疗最佳剂量。第三部分糖尿病大鼠主动脉硬化模型的构建目的:建立自发糖尿病（GK）大鼠主动脉硬化动物模型。方法:88只雄性GK大鼠随机分为正常GK对照组、建模组,每组44只,期间观察大鼠一般情况变化。实验结束时,8周后,测定各组动物体重、尿量、空腹血糖、餐后2小时血糖、胰岛素、血清脂联素、糖化血红蛋白、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度酯蛋白（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度酯蛋白（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）,同时随机取主动脉用光镜及电镜观察主动脉超微结构及病理改变。结果:与正常GK对照组比较,模型组大鼠体重增加缓慢,尿量、空腹血糖、餐后2小时血糖、胰岛素、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇明显升高（P＜0.05）,血清脂联素、高密度酯蛋白胆固醇降低（P＜0.05）。电镜下主动脉超微结构观察显示:正常GK对照组主动脉硬化血管内皮细胞质内未见小脂滴空泡,各种细胞器存在,内弹力膜存在,中层平滑肌细胞质内无脂滴空泡。模型组出现主动脉肥大,内皮细胞内脂滴空泡沉积,动脉内中膜内有泡沫细胞形成,病理显示明显的主动脉及动脉内膜病变。结论:通过高脂、一氧化氮合成酶抑制剂,可成功构建自发糖尿病大鼠主动脉病变,用作糖尿病大鼠大血管病变研究的动物模型。第四部分rAAV2/1-Acrp30对GK大鼠大血管病变的影响及机理第一章rAAV2/1-Acrp30对糖尿病主动脉硬化模型大鼠糖脂代谢及超微结构的影响目的:研究rAAV2/1-Acrp30对GK主动脉硬化大鼠糖脂代谢的调节作用及超微结构的影响。方法:采用GK主动脉硬化大鼠为实验模型,观察rAAV2/1-Acrp30对血脂、主动脉超微结构的影响。将30只动脉硬化大鼠随机分为模型1组、模型2组、rAAV2/1-Acrp30组等3组,3组分别给予盐水、空病毒、rAAV2/1-Acrp30。8周后,测定各组动物体重、尿量、血清总胆固醇（toral cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度酯蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度酯蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、胰岛素、糖化血红蛋白、空腹血糖和餐后2小时血糖水平,同时用光镜和电镜观察主动脉超微结构。结果:与模型1,2组比较,rAAV2/1-Acrp30治疗可以显著降低GK动脉硬化大鼠空腹血糖、餐后2小时血糖、TC、TG、LDL-C、糖化血红蛋白水平（P＜0.05）:增加体重,升高HDL-C（P＜0.05）;但血清胰岛素水平无变化（P＞0.05）。电镜下主动脉超微结构观察显示:rAAV2/1-Acrp30组主动脉硬化病变较模型组轻,血管内皮细胞质内偶见小脂滴空泡,各种细胞器存在,内弹力膜存在,中层平滑肌细胞质内无脂滴空泡及泡沫细胞的形成。结论:rAAV2/1-Acrp30能降低GK动脉硬化大鼠血糖,调节的血脂代谢,对主动脉超微结构有修复作用。第二章rAAV2/1-Acrp30对糖尿病动脉硬化模型大鼠粘附因子和主动脉PPAR家族基因的调控目的:观察rAAV2/1-Acrp30对实验性GK主动脉硬化大鼠血清粘附因子、C反应蛋白、主动脉核因子κB和PPAR家族基因的调控。方法:GK主动脉硬化大鼠随机分为模型1组、模型2组、rAAV2/1-Acrp30组等3组,3组分别给予盐水、空病毒、rAAV2/1-Acrp30。4周时眶静脉采血一次,8周后,麻醉处死大鼠,测定各组大鼠血清C反应蛋白、E选择素、可溶性细胞间黏附分子、可溶性血管内皮黏附分子水平、脂联素,分离主动脉,RT-PCR检测PPARα、PPARγmRNA、NF-κBmRNA表达。结果:与模型1,2组相比,rAAV2/1-Acrp30可以显著降低血清C反应蛋白、E选择素、可溶性细胞间黏附分子、可溶性血管内皮黏附分子水平（P＜0.05）;NF-κBmRNA表达被抑制（P＜0.05）,主动脉PPARγmRNA、PPARαmRNA则上调（P＜0.05）,但血清脂联素水平无变化（P＞0.05）。结论:rAAV2/1-Acrp30可能通过上调GK主动脉硬化大鼠主动脉PPAR家族基因,抑制核因子NF-κB的表达,降低C反应蛋白、粘附因子,对动脉粥样硬化病变有修复作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略语英文索引
• 论文正文
• 前言
• 技术路线
• 第一部分 rAAV2/1-Acrp30病毒的获得与纯化
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 AAV2/1-Acrp30在大鼠体内表达的比较研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部 糖尿病大鼠主动脉硬化模型的构建
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 rAAV2/1-Acrp30对GK大鼠大血管病变的影响及机理
• 第一章 rAAV2/1-Acrp30对2型糖尿病动脉硬化模型大鼠糖脂代谢及超微结构的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 rAAV2/1-Acrp30对2型糖尿病动脉硬化模型大鼠粘附因子和主动脉PPAR家族基因的调控
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 存在的问题与展望
• 参考文献
• 综述 腺相关病毒载体与基因治疗的研究进展
• 研究成果及发表论文
• 个人简介
• 致谢