论文摘要
目的假体无菌性松动是人工关节置换术后最常见的并发症之一,也是人工关节置换术远期失败的主要原因,它是一个复杂的、多步骤和多因素参与的炎性因子与破骨细胞相互作用的过程。越来越多的研究证实,无菌性松动假体周围肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα, TNF-α）明显增高,增高肿瘤坏死因子可导致破骨细胞分化活性增强,继而形成假体周围异常骨溶解导致假体无菌性松动和失败。依那西普（Etanercept）是全人源化抗肿瘤坏死因子α拮抗剂,以TNF-α为靶标的治疗药物,其机制为竞争性和TNF-α受体结合,阻断TNF-α和细胞表面TNF受体结合,降低TNF-α活性,从而达到治疗与TNF-α相关的疾病。近年研究显示,依那西普不但能使类风湿症患者状体征改善而且阻止局部骨结构破坏,这可能与依那西普能通过抑制破骨细胞活性相关。目前,抑制破骨细胞生长及功能的破骨细胞靶疗法在治疗假体周围异常骨溶解和无菌性松动等方面日益得到重视。因此,本研究以此为切入点,一方面通过体外大鼠骨髓细胞悬液诱导培养破骨细胞方法,明确体外培养的大鼠破骨细胞生物学特性即分化、成熟、活性、骨吸收特征与TNF-α的相关性。另一方面通过对不同浓度的依那西普添加后,体外TNF-α、PTH（Parathyroid hormone,PTH）诱导培养的骨片上大鼠破骨细胞骨吸收陷窝数的观察以及这些因子表达水平之间是否存在差异性,明确依那西普是否通过阻断TNF-α诱导的破骨细胞,而抑制骨片上骨吸收陷窝。通过以上研究,进一步明确依那西普拮抗TNF-α,抑制破骨细胞的形成、功能的机制;以及不同浓度条件下依那西普抑制破骨细胞能力;探讨依那西普抑制抑制TNF-α刺激培养破骨细胞分化形成和功能的机制;探寻假体周围骨溶解预防、治疗的新途径。方法预先制备4 mm×4 mm牛皮质骨骨磨片。采用出生4-6天的SD大鼠,拉颈处死,75%乙醇侵泡3 min。无菌条件下分离四肢长骨（股骨和胫骨）,在冷D-Hank’s中去除骨骺及骨表面软组织,用不含血清的α-MEM培养液冲洗髓腔,收集骨髓细胞并用培养液洗涤2次,均匀处理后分别置于未处理、PTH浓度为10-8M、TNF-α浓度为10 ng/ml含15%胎牛血清的α-MEM培养液中诱导培养,细胞悬液以1.5×109/L的密度移入细胞培养板,孔内预先放置骨片。37℃、体积分数5%CO2条件下培养20 min后冲去未贴壁的细胞。每3天换一次培养液,换液时分别加入1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml的依那西普,培养10天。此外,另设对照组加入1 ug/ml IgG1抗体。培养10天后取出骨片,自然凉干。甲苯胺蓝染色5 min,蒸馏水冲洗,光镜（×40）下观察骨吸收陷窝;骨磨片行扫描电镜检查;对扫描电镜图像用image-pro plus 5.0图像分析软件分析骨吸收陷窝的面积及不同浓度依那西普抑制骨吸收陷窝形成的面积。统计学分析:每次实验中各组中剂量亚组分别设3个骨磨片,实验重复3次。数据均以均数±标准误表示,所有结果均以SPSS13.0分析。在比较骨吸收陷窝面积差异时采用Student’s t检验,以P <0.05认为差异有统计学意义。结果①PTH、TNF-α均能够直接诱导大鼠BMCs中破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞。②TNF-α能促破骨细胞分化;在TNF-α组,小剂量依那西普即能抑制破骨细胞骨片吸收陷窝面积;而依那西普10 ng/ml组就近完全抑制破骨细胞骨片吸收陷窝面积。在未处理组、PTH组,依那西普呈剂量依赖性抑制破骨细胞骨片吸收陷窝面积;剂量越大,抑制越明显,但不能完全抑制;且未处理组较PTH组更为明显。③在对照组IgG1作用下破骨细胞骨吸收面积无明显变化。结论①在体外实验中通过骨片吸收陷窝面积抑制率检测,验证了依那西普能抑制破骨细胞骨吸收功能。同时发现,依那西普大剂量组（1000ng/ml）能明显减少实验各组的骨吸收面积。②在TNF-α组,依那西普10 ng/ml组就近完全抑制。在未处理组、PTH组,依那西普呈剂量依赖性抑制破骨细胞形成和功能;在IgG1对照组不能抑制破骨细胞骨吸收功能。③本实验发现在单独TNF-α刺激组骨吸收陷窝面积没有增加;而在PTH组骨吸收陷窝面积增大。这些暗示是TNF-α、PTH通过不同的途径影响破骨细胞骨吸收功能的;TNF-α单独刺激诱导破骨细胞分化或破骨细胞功能是不足的。
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