CCK-8对脂多糖诱导小鼠分泌IL-12的影响及其机制研究

论文摘要

目的:胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）是广泛分布于体内多个系统的神经肽,作为神经递质或调质发挥重要作用,具有多种生物学功能,如调节摄食、焦虑、记忆等。我室以往的研究发现,八肽CCK（CCK-8）具有一定的免疫调节及抗炎作用,体外实验证实,CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠PIMs的NF-κB活性,导致PIMs对LPS的敏感性降低,从而抑制脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6。IL-12是90年代初命名的白细胞介素家族新成员,在机体的免疫调节中起着重要的作用。它能诱导NK细胞和T细胞产生细胞因子（主要是γ干扰素）,促进NK细胞及细胞毒性T细胞（CTL）的形成并提高其细胞毒性,诱导Th1细胞分化并抑制Th2细胞分化,它甚至可以使已建立的Th2型为主的反应向Th1型转变。IL-12由p35和p40两个亚单位组成,p35基因在多种细胞中表达,而p40基因的表达只限于具有抗原提呈功能的吞噬细胞,因此,p40基因被认为是IL-12表达的调节亚基。IL-12在免疫应答、炎症反应和抗肿瘤中的作用,使人们对IL-12基因转录产生了浓厚的兴趣。LPS/IFNγ诱导p40基因表达的功能性启动子区域已被鉴定。这一区域的-132/-122含有NF-κB结合位点,而-211/-207含有Ets-2元件, NF-κB是LPS/IFNγ刺激后导致巨噬细胞IL-12p40转录发生最大效应的主要转录调节因子。有研究表明血管活性肠肽（VIP）和垂体腺苷酸激活多肽（PACAP）抑制IFNγ和LPS刺激的巨噬细胞产生IL-12。但同属神经肽的CCK是否对IL-12的分泌具有调节作用,如果具有调节作用其细胞内机制如何尚未见研究报道。因此,本实验将观察CCK-8对脂多糖诱导的小鼠分泌IL-12的影响,以探讨CCK-8调节Th1/Th2平衡的作用是否与IL-12有关。方法:健康BALb/C雌性小鼠108只,随机分为6组:（1）生理盐水对照组（NS组）:腹腔注射生理盐水0.3ml。（2）LPS组:腹腔注射LPS 5mg/kg（LPS 1mg/ml, 0.1ml/20g）;（3）LPS+CCK组:腹腔注射CCK-8 5nmol（CCK-8 1mg/L, 0.1ml/20g）,10 min后腹腔注射LPS 5mg/kg（LPS 1mg/ml, 0.1ml/20g）;（4）单独CCK组:腹腔注射CCK 5nmo（lCCK-8 1mg/L, 0.1ml/20g）;（5）CR1409组:腹腔注射CR-1409 5μg/kg（CR-14091mg/L, 0.1ml/20g）,30 min后腹腔注射CCK-8 5nmol （ CCK-8 1mg/L, 0.1ml/20g）,10 min后腹腔注射LPS 5mg/kg（LPS 1mg/ml, 0.1ml/20g）;（6）CR2945组:腹腔注射CR-2945 5μg/kg（CR-2945 1mg/L, 0.1ml/20g）,30 min后腹腔注射CCK-8 5 nmol（CCK-8 1mg/L, 0.1ml/20g）,10 min后腹腔注射LPS 5mg/kg（LPS 1mg/ml, 0.1ml/20g）。肺、脾冻存于液氮中,留置血清于-70℃。用ELISA法检测血清、肺、脾组织中IL-12p40、p70的表达。Western Blot方法检测IκB和p-IκB、p38和p-p38的表达。观察CCK-8对脂多糖诱导小鼠IκB、p38磷酸化水平的影响。EMSA方法检测各组小鼠肺、脾组织NF-κB/DNA结合活性。结果:1 CCK-8对脂多糖诱导小鼠血清、肺、脾组织IL-12 p40、p70蛋白表达的影响:小鼠血清、肺、脾组织IL-12 p40浓度LPS组（207.89±53.31 ng/L、111.16±9.55 ng/L、78.3±8.35 ng/L）均较NS组（46.02±15.62ng/L、49.10±6.24ng/L、46.32±8.41ng/L）增高（P<0.01）,LPS+CCK组（327.74±63.08ng/L、174.56±10.82ng/L、108.41±10.21ng/L）IL-12p40浓度较LPS组增高（P<0.01）, IL-12 p40浓度CR1409组（293.29±118.63ng/L、160.04±4.30 ng/L、93.08±5.02ng/L）、CR2945组（212.88±52.81ng/L、143.58±8.53ng/L、82.16±4.02ng/L）较LPS+CCK组降低（P<0.05）;小鼠血清、肺、脾组织IL-12p70浓度LPS组（145.64±3.84ng/L、47.01±3.19ng/L、85.69±6.00ng/L）均较NS组（17.44±4.61ng/L、26.94±7.59ng/L、44.54±5.51ng/L）增高（ P<0.01）, LPS+CCK组（240.37±45.72ng/L、86.09±6.74ng/L、111.85±15.97ng/L）IL-12 p70浓度较LPS组增高（P<0.01）, IL-12p70浓度CR1409组（ 160.93±19.21ng/L、67.59±7.32ng/L、97.24±6.19ng/L ）、CR2945组（ 165.54±14.70ng/L、52.34±8.96ng/L、90.02±6.35ng/L）较LPS+CCK组降低（P<0.05）。2 CCK-8对脂多糖诱导小鼠肺、脾组织IκB、p38磷酸化水平和NF-κB/DNA结合活性的影响:小鼠在给予生理盐水、脂多糖、CCK-8及CCK受体拮抗剂后肺、脾组织总的IκB、p38表达在各组之间有所不同,但各组之间均无显著性差异（P>0.05）;小鼠肺、脾组织pIκB蛋白表达LPS组（0.80±0.28）较NS组（0.32±0.04）升高（P<0.01）;LPS+CCK组（0.52±0.33）pIκB蛋白表达低于LPS组（P<0.01）;与LPS+CCK组相比,CR1409组（0.59±0.02）、CR2945组（0.75±0.07）pIκB蛋白表达水平升高,CR2945组较CR1409组升高明显;小鼠肺、脾组织p-p38蛋白表达LPS组（0.40±0.3）较NS组（0.17±0.03）升高（P<0.01）;LPS+CCK组（0.56±0.03）p- p38蛋白表达高于LPS组（0.40±0.03）（P<0.05）;与LPS+CCK组相比,CR1409组（0.45±0.04）、CR2945组（0.43±0.03）p-p38蛋白表达水平降低,CR2945组较CR1409组降低明显。小鼠肺、脾组织NF-κB/DNA结合活性LPS组（59496.33±1332.43）较NS组（7830.33±1057.92）升高（P < 0.01） ; LPS+CCK组（30297.03±1083.77）与LPS组相比NF-κB/DNA结合活性降低（P<0.01）;与LPS+CCK组相比,CR1409组（39358.67±564.96）、CR2945组（49615.03±1200.15）小鼠肺、脾组织NF-κB/DNA结合活性升高,CR2945组较CR1409组升高明显。结论:CCK-8可促进脂多糖诱导小鼠血清、肺、脾组织IL-12p40、p70表达的异常增高,抑制IκB磷酸化水平及NF-κB/DNA结合活性的异常增高,而增加了p38磷酸化水平,CCK-8可能通过增加p38磷酸化水平而促进脂多糖诱导的小鼠血清、肺、脾组织IL-12p40、p70表达的异常增高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 CCK-8 对脂多糖诱导小鼠分泌 IL-12 的影响及其机制研究
• 引言
• 第一部分 CCK-8 对脂多糖诱导小鼠分泌 IL-12 的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 CCK-8 对 LPS 诱导小鼠肺、脾组织 IκB、p38 磷酸化水平和 NF-κB/DNA 结合活性的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 白细胞介素-12的免疫调节作用
• 致谢
• 个人简历