天山马鹿鹿茸血源ACE抑制肽的研究

论文摘要

高血压是引发心血管疾病如心力衰竭、中风、冠心病和心肌梗塞的重要危险因子,已成为严重危害人类健康的主要疾病之一。ACE抑制剂作为有效的治疗抗高血压药物而被广泛的应用于临床。这些抑制剂主要是一些化学合成药,在治疗高血压过程中,存在一定副作用如味觉障碍、血管水肿和干咳等。ACE抑制肽由于其安全性高,副作用小,易吸收,而成为生物活性肽研究领域的热点。天山马鹿鹿茸血内含丰富的蛋白质、氨基酸、各种免疫球蛋白和多种微量元素,还含有多糖、及各种酶类和维生素。在这些蛋白质中含有许多潜在的ACE抑制肽,通过选择合适的酶解工艺,可以制备得到大量的ACE抑制肽。对天山马鹿鹿茸血ACE抑制肽的研究拓宽了天山马鹿鹿茸血的综合利用途径。本课题以天山马鹿鹿茸血为原料,采用蛋白酶水解工艺制备天山马鹿鹿茸血水解物。分别采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对天山马鹿鹿茸血进行酶解,根据水解物ACE抑制活性的的强弱,选择碱性蛋白酶Alcalase作为制备ACE抑制肽的水解酶。通过单因素试验和正交试验对酶解工艺中的四个重要参数进行优化,确定出碱性蛋白酶酶解的最佳工艺如下:底物浓度6%、加酶量40μl/g蛋白、pH 8.0、温度55℃。在该条件下进行天山马鹿鹿茸血酶解3 h,水解度为28.0%,ACE抑制率为93.55%。用分子筛层析柱Sephadex G-15对天山马鹿鹿茸血的碱性蛋白酶Alcalase水解物进行分离纯化,在如下分离条件下进行凝胶过滤分离取得较好的的分离效果:凝胶柱,1.8×60 cm;样品浓度,50 mg/ml;上样量,1.5 ml;流速,0.4 ml/min;洗脱剂,0.02 mol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 4.0）。经凝胶过滤制备的得到的ACE抑制肽组分,经过两次RP-HPLC后得到高纯度的单一活性组分。该组分经LC/MS鉴定,从天山马鹿鹿茸血碱性蛋白酶Alcalase水解物中分离得到的一种新的ACE抑制肽Pro-Pro-Leu-Tyr（PPLY）,其IC50值为11.5μM。利用药物设计软件InsightⅡ建立PPLY的分子模型,将该分子模型与ACE进行分子对接,得到PPLY在ACE中的结合部位包括Y62、N66、Y69、L140、E143、H353、A354、F359、Y360、K368、H383、E384、H387、F391、Y392、R402、G404、H410、E411、F512、H513、P519、R522和Y523残基,该部位位于ACE的空腔内,占据了ACE催化区域的大部分,其结合能为-31.9821kcal/mol,其中静电作用能为-24.4872 kcal/mol,范德华力作用能为-6.4944kcal/mol。ACE抑制肽PPLY结合能较ACE抑制剂Lisinopril与ACE的结合能低,更容易与ACE结合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪言
• 1.1 高血压
• 1.1.1 高血压现状
• 1.1.2 高血压目前的治疗手段
• 1.2 血管紧张素转化酶
• 1.2.1 ACE对血压的调节作用
• 1.2.2 ACE抑制剂
• 1.2.3 ACE抑制剂的基本药理作用及其作用机制
• 1.3 ACE抑制肽
• 1.3.1 ACE抑制肽的来源
• 1.3.2 ACE抑制肽的制备方法
• 1.4 立题意义与主要研究内容
• 第二章 天山马鹿鹿茸血的蛋白酶酶解条件优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料和主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 天山马鹿鹿茸血蛋白质含量测定
• 2.2.3.2 蛋白酶的选择
• 2.2.3.3 水解度的测定（PH-STAT法）
• 2.2.3.4 酶解产物的ACE抑制活性的体外检测
• 2.2.3.5 酶解条件的优化
• 2.2.3.6 天山马鹿鹿茸血水解物的抗氧化活性测定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 天山马鹿鹿茸血蛋白浓度测定
• 2.3.2 Alcalase和Neutrase处理天山马鹿鹿茸血效果比较
• 2.3.3 天山马鹿鹿茸血水解工艺关键参数的单因素优化
• 2.3.3.1 pH对酶解的影响
• 2.3.3.2 温度对酶解的影响
• 2.3.3.3 底物浓度对酶解的影响
• 2.3.3.4 酶浓度对酶解的影响
• 2.3.4 天山马鹿鹿茸血水解工艺关键参数的正交优化
• 2.3.5 天山马鹿鹿茸血的抗氧化活性
• 2.4 本章小结
• 第三章 ACE抑制肽的纯化及鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 天山马鹿鹿茸血水解物的制备
• 3.2.3.2 Sephadex G-15分离纯化ACE抑制肽
• 3.2.3.3 RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽
• 3.2.3.4 LC/MS鉴定ACE抑制肽氨基酸序列
• 50测定'>3.2.3.5 ACE抑制活性的测定及纯化的ACE抑制肽IC₅₀测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Sephadex G-15分离ACE抑制肽
• 3.3.1.1 不同样品浓度对Sephadex G-15分离ACE抑制肽效果的影响
• 3.3.1.2 洗脱液不同流速对Sephadex G-15分离ACE抑制肽效果的影响
• 3.3.1.3 Sephadex G-15分离蛋白质水解物所得不同组分的ACE抑制活性
• 3.3.2 半制备HPLC分离纯化ACE抑制肽
• 3.3.3 ACE抑制肽的结构测定
• 50的测定'>3.3.4 ACE抑制肽IC₅₀的测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 ACE抑制肽的作用模式分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 ACE抑制肽PPLY分子模型的建立
• 4.2.2.2 ACE抑制肽PPLY分子与ACE的对接
• 4.3 结果
• 4.3.1 ACE构象分析
• 4.3.2 ACE活性位点分析
• 4.3.3 ACE抑制剂Lisinopril作用机制分析
• 4.3.4 ACE抑制肽PPLY分子模型
• 4.3.5 PPLY与ACE的对接及其作用模式分析
• 4.4 本章小结
• 论文主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文