论文摘要
糖尿病（Diabetic mellitus, DM）现已成为全球日益关注的公共健康问题。机体长期处于高血糖状态,可以引发各种糖尿病慢性并发症,如糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变以及糖尿病肾病（Diabetic nephropathy, DN）等。其中,DN是糖尿病最严重的并发症之一,也是临床终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）发病最主要的原因。DN早期特征性的病理学改变有肾小球肥大、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积,基底膜增厚等,晚期发展为肾小球硬化和肾小管间质弥漫性纤维化。DN的发病机制尚不清楚,目前认为是高血糖、糖基化终末产物形成与堆积、氧化应激、炎症、血流动力学异常以及遗传背景等各种因素共同参与和发展的结果。内质网（endoplasmic reticulum, ER）是细胞胞浆中由膜构成的细胞器,位于细胞核附近。除原核细胞和哺乳动物成熟的红细胞外,ER普遍存在于所有真核细胞。正常情况下,ER具有非常强大的维持细胞内稳态功能,当某种原因（葡萄糖或营养物质的缺乏、脂质过度负荷、毒素或分泌蛋白合成过多、Ca2+代谢失衡、缺血再灌注与氧化应激等）打破了细胞稳态,使细胞内蛋白质合成速度过快,超过了ER折叠能力,导致ER处于一种生理功能紊乱的状态,即形成内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。最近几年研究发现,ERS与糖尿病及其并发症的发生与发展密切相关。ERS由ER膜上的三条跨膜蛋白介导,包括肌醇需要酶1（inositol requiring enzyme1,IRE1）、蛋白激酶受体样内质网激酶（protein kinase receptor-like ER kinase,PERK）和激活转录因子6（activating transcription factor6,ATF6）。其中IRE激活后,剪接下游的X盒结合蛋白（X-box binding protein1,XBP1）,XBP1经剪接后翻译成为有转录调节活性的XBP1S。IREl/XBP1是在内质网应激中最保守最重要的一条信号通路。XBP1广泛存在于内分泌、消化以及生殖等系统的各组织器官。XBP1S是ER应激的关键转录调节因子,既往研究证实XBP1S与细胞的分化、血浆蛋白的分泌、以及细胞的生存与凋亡密切相关,在大多数生理状态下对细胞起保护作用。近年来许多研究证实,XBP1S与糖尿病发展也密切相关,参与了胰岛素抵抗,糖代谢异常,糖尿病视网膜病变,糖尿病中枢系统损伤以及DN等病理过程。大量的在体与离体实验研究证实,肾脏组织活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）生成增多是导致糖尿病肾损害的重要原因。糖尿病早期,高血糖环境刺激增加细胞NADPH氧化酶的活性,引起ROS明显升高。ROS的过度生成参与了细胞的肥大、增殖与凋亡等病理过程。肾实质细胞的丢失是DN病理特征之一,无论是动物还是DN病人,实质细胞的丢失会加速病情的恶化,并加剧蛋白尿的生成。肾脏系膜细胞（Mesangial cells, MCs）是肾小球重要的固有细胞,无论在糖尿病病人还是糖尿病动物模型上,都能观察到MCs凋亡的发生。ROS是导致凋亡的重要原因之一,ROS亦是引起ER应激的病因之一,两者相互作用,共同参与了DN的过程。XBP1S在不同的细胞凋亡发生中的调节作用截然不同,可以发挥促凋亡或抗凋亡的截然相反的作用：此外,亦有文献报道,XBP1具有抗氧化应激的作用。然而,在DN情况下,XBP1S与ROS以及凋亡之间的关系仍不是很清楚,如果XBP1S对系膜细胞具有抗氧化与抗凋亡的作用,那么其作用的分子机制如何?CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）是ERS中与细胞凋亡调节密切的相关的基因,既往的大部分观点认为其具有促凋亡作用,且启动子区域含有XBP1的结合位点。据报道：在肝癌细胞,XBP1S通过反向调节CHOP促进细胞的存活。为此,在本研究中,我们观察了在离体培养的大鼠肾脏系膜细胞上,给予高浓度葡萄糖刺激后,观察ROS变化、XBP1S表达的改变以及系膜细胞凋亡的变化；并探讨了XBP1S的改变与高糖导致MCs氧化应激发生以及凋亡的关系,及其可能作用的分子机制。通过上述研究,试图阐明XBP1S在DN中作用以及机制。实验共分为四个部分：一、XBP1S在高糖激活MCs氧化应激中的作用及机制研究1.首先,在离体培养的大鼠肾脏MCs上,观察了高糖刺激（HG,30mmol/L D-葡萄糖）对细胞中ROS生成的影响。系膜细胞给予高糖刺激（12h,24h和48h）后,ROS出现明显升高。用NADPH氧化酶抑制剂DPI （Diphenylene-chloride iodonium,10-6mol/L）可以抑制高糖引起的ROS升高。Western blot结果显示,在高糖刺激后,NADPH氧化酶中p47phox亚单位的蛋白水平明显升高。2. Western blot结果显示,在原代培养的大鼠MCs以及大鼠MCs系中,高糖引起XBP1S蛋白水平的明显降低,而XBP1U的蛋白水平在高糖刺激前后并未出现明显的变化；RT-PCR与qPCR技术进一步证实了XBP1S的mRNA水平在高糖刺激后有显著降低。3.在离体培养的大鼠肾脏MCs上,用腺病毒表达载体构建技术转染过表达XBP1S后,观察到与表达绿色荧光蛋白的细胞相比较,过表达XBP1S可以明显降低高糖引起的ROS升高以及p47phox蛋白水平的升高。4.MCs转染siRNA （50nM）抑制XBP1S表达后,观察到细胞中ROS水平升高以及p47phox蛋白水平的升高。这部分的实验结果说明高糖情况下,ROS的过度生成可能主要来源于NADPH氧化酶途径。XBP1S在高糖条件下表达降低可能与ROS生成增加有关,XBP1S具有抑制氧化应激发生的功能,XBP1S的抗氧化作用与降低NADPH氧化酶的胞浆亚单位p47phox表达,从而降低NADPH氧化酶活性有关。二、XBP1S在高糖导致MCs凋亡中的作用1.在离体培养的大鼠肾脏MCs中,用流式细胞术观察了高糖对凋亡的影响。细胞给予高糖刺激后,Annexin-V标记的凋亡细胞数明显增加。使用Western blot技术观察到,给予细胞高糖刺激后,细胞中与前凋亡相关的基因Bax与Bcl2的比率明显升高,凋亡的执行基因caspase3的前体与剪切体蛋白水平在高糖刺激下也明显升高。2.在正常培养的MCs中,与表达绿色荧光蛋白的细胞组比较,Western blot结果显示,过表达XBP1S既可以降低Bax与Bcl2的比率,又明显降低caspase3的前体与剪切型蛋白的水平。3.在高糖培养的MCs中,Western blot结果显示,过表达XBP1S可以降低高糖引起的Bax与Bcl2的比率升高以及caspase3前体与剪切型蛋白水平的升高。4.在正常培养的MCs中,MCs转染siRNA （50nM）抑制XBP1S表达后,Western blot结果显示,caspase3的前体与剪切体蛋白水平的升高。5.NADPH氧化酶抑制剂DPI（10-6mol/L）处理48h可以抑制高糖引起的Bax与Bcl2的比率升高以及caspase3的前体与剪切体蛋白水平的升高。6.MCs给予H2O2（1×10-4uM）刺激4h后,Western blot显示caspase3的前体与剪切体的蛋白水平的增加。该部分实验结果说明,高糖引起MCs凋亡增加,ROS升高是导致凋亡的原因之一；XBP1S具有抗凋亡作用,其抗凋亡作用与Bax/Bcl2以及caspase3等基因有关。三、XBP1S在高糖导致MCs凋亡中的机制研究1.在离体培养的大鼠肾脏MCs观察了高糖对CHOP的影响。我们使用Western blot技术观察到,高糖刺激条件下,CHOP的蛋白水平明显降低；qPCR技术也证实了CHOP的mRNA水平明显降低。2.使用染色质免疫共沉淀方法观察到XBP1结合于CHOP的启动子区域;过表达XBP1S增加CHOP的蛋白水平。3.MCs转染siRNA（50nM）抑制CHOP表达后,Western blot结果显示Bax/Bcl2以及caspase3的前体与剪切体蛋白水平未发生变化。4.MCs转染siRNA（50nM）抑制CHOP表达后,较对照组,Western blot结果显示：凋亡性坏死相关蛋白BNIP3的蛋白水平明显增加；流式细胞检测技术结果显示,PI标记的坏死细胞数明显增加。5.利用流式细胞术观察到,高糖刺激下,PI标记的坏死细胞数明显增加。其次Western blot结果观察到,高糖刺激条件下,BNIP3的蛋白水平明显增加；过表达XBP1S48h后可明显降低高糖引起的BNIP3的蛋白水平升高。该部分实验结果说明,XBP1可直接调控CHOP的表达,而且对CHOP是正向调控；XBP1通过CHOP调控高糖引起的细胞坏死,但XBP1S对凋亡的作用无CHOP无关。四、XBP1S在高糖导致肾脏纤维化中的影响1.在离体培养的大鼠肾脏MCs中,观察了高糖对细胞外基质分泌的影响。细胞分别在高糖环境中培养24h、48h与72h,收集细胞的培养液,Western blot结果显示细胞外基质蛋白Fibronectin与Collagen IV的蛋白水平增加。2.过表达XBP1S后,再给予高糖刺激48h,收集细胞培养液,Western blot结果显示过表达XBP1S可明显降低高糖引起的Fibronectin与Collagen IV的蛋白水平增加。3.给予大鼠腹腔注射STZ建立Ⅰ型糖尿病动物模型,8周后,收集大鼠肾皮质组织并提取蛋白,Western blot结果显示,相比较于正常对照组动物,糖尿病组大鼠肾脏皮质组织中Fibronectin与Collagen IV的蛋白水平明显增加,p47phox蛋白水平明显升高；4.相较于正常对照组动物,糖尿病组大鼠肾脏皮质组织中XBP1S与CHOP的蛋白水平降低,caspase3的前体与剪切体与BNIP3蛋白水平明显增加。该部分实验结果说明,MCs及肾脏组织中细胞外基质蛋白生成增加,细胞外基质蛋白合成增加,可导致纤维化的发生。XBP1S过表达可明显减轻高糖刺激引起的细胞外基质蛋白合成增加；在糖尿病动物模型中,观察到肾脏组织氧化应激的发生,并伴有细胞外机制蛋白合成增加,以及XBP1S与CHOP的蛋白水平降低,而凋亡与坏死的蛋白水平升高。综上所述,本课题研究结果表明XBP1S在高糖环境中表达降低,XBP1S水平降低与高糖引起的MCs氧化应激与凋亡有关：XBP1S的降低导致了ROS的过度生成以及后续的细胞凋亡,其调节细胞ROS水平的机制可能与调节p47phox表达有关；高糖可以引起MCs的凋亡与坏死,XBP1S具有抗凋亡与抗坏死作用,其抗凋亡作用可能与调节Bax, Bcl2以及caspase3等基因表达有关；XBP1可直接调控CHOP, XBP1S的抗凋亡作用与CHOP无关,XBP1S的抗坏死作用可能与调控CHOP有关。本课题研究结果为认识XBP1S在高糖环境中的改变,及在糖尿病肾脏损害中的作用,糖尿病致肾脏损害发生机制提供了新的实验依据。