小清蛋白在孤独症模型大鼠情绪与认知相关脑区的表达及其发育研究

论文摘要

孤独症（Autism）是一种严重的广泛性神经发育障碍性疾病,多数三岁内起病,男女发病比例为4:1。尽管有针对一些行为异常的治疗,但无法治愈,预后大多较差,严重影响儿童的身心发展,使它成为对家庭、社会还有患儿最具有灾难性的儿童疾病之一。现在已经清楚孤独症是一个综合征,并且具有很强的遗传性。孤独症的病因在细胞和分子水平都还没有被阐明。现在很多学者认为孤独症是中枢神经系统发育过程中兴奋与抑制功能失衡所致。研究表明,孤独症病人有合成GABA的谷氨酸脱羧酶（GAD）水平的下降;相反,谷氨酸能神经递质水平上升。小清蛋白（Parvalbumin,PV）是一种低分子量的Ca2+结合蛋白（CaBPS）,PV阳性神经元是一种抑制性中间神经元,它标记了那些高代谢和高电活动的GABA能中间神经元亚群。电镜可见PV阳性神经末梢可以与周围的锥体细胞的轴突始段形成对称性突触（抑制性突触）。而且PV阳性神经元在发育过程中出现较晚,可能参与突触的形成和功能的成熟。所以PV及PV阳性神经元必定在孤独症的发生过程中起到一定的作用。而PV在孤独症模型大鼠脑内的变化也可以在一定程度上反映抑制性神经递质的变化情况,可为孤独症的研究提供形态学依据。通过对孤独症病人脑的神经解剖学检查和功能与结构MRI的研究,发现孤独症有边缘系统、小脑、胼胝体、基底节、脑干和和皮层等主要脑区的病变。对孤独症患者脑的神经病理学研究发现,海马、杏仁体和内嗅皮层等脑区的神经细胞构架都发生了异常（细胞体积变小,密度增大）。边缘系统和大脑皮层都是与孤独症相关的情绪与认知的重要脑区。这些脑区中尤以情绪与认知相关的脑区最重要。其中以边缘系统的杏仁体、海马与前额叶皮层更具代表性。杏仁体的基底外侧核（BLA）被认为是进入杏仁体的感觉输入区,它与新皮层、丘脑和海马结构存在广泛的联系。那么,在孤独症的主要情绪与认知相关脑区内PV的表达是否会产生变化?这种变化是在发育过程中哪个阶段出现的?它在孤独症发病过程中起到什么作用?是值得研究的问题。为此,本实验做了如下研究:第一部分:通过孕鼠腹腔注射VPA和反复冷冻刺激（RCS）的方法建立两种成熟的孤独症大鼠动物模型。用免疫组化的方法,观察成年（12w）孤独症模型大鼠脑内情绪与认知相关脑区:杏仁体、前额叶皮层和海马区PV阳性神经元的表达情况,并与正常对照组进行比较。结果显示:两种孤独症模型鼠杏仁体、前额叶皮层和海马区内的PV免疫反应阳性神经元的胞体形态、大小、突起的长度和密度等与正常对照组（CTL）相比,都发生了不同程度的变化。而且两种模型中前额叶皮层与杏仁体区PV阳性神经元的变化一致,海马区则不同;两种模型在各个脑区的变化也不尽相同。这些结果提示:PV中间神经元在孤独症的发病过程中发挥了重要的作用,它们的改变可能削弱了对孤独症相关的神经环路中锥体神经元的抑制作用;前额叶皮层与杏仁体区在孤独症发病过程的作用可能相近,而海马区则不同;两种模型的干预措施对各脑区的影响也不同,孕鼠腹腔注射VPA可能主要影响仔鼠杏仁体和前额叶皮层的发育,而孕鼠RCS可能主要影响仔鼠海马区的发育。第二部分:用孕鼠腹腔注射VPA的方法,获得子代孤独症模型大鼠。根据孤独症发病特点及PV的表达特点,分别取发育过程中不同时间点的孤独症模型大鼠杏仁体区、前额叶皮层区和海马区,用Golgi染色和RT-PCR等方法,观察VPA模型组大鼠和正常大鼠发育过程中情绪与认知相关脑区PV的表达情况,并进行对比。结果显示:正常大鼠在出生至第一周末,各个脑区内mRNA水平的PV表达量很少,几乎检测不到;第二周出现PV表达量的显著增加,这种增加持续到第三周末,但是第四周期间又出现PV表达量的急剧减少,四周之后海马区的PV表达量将维持在较低的水平,而杏仁体（BLA）区和前额叶皮层区的PV表达量则缓慢恢复到三周时的高水平。孤独症模型鼠不同脑区各个时间段的PV表达水平均较正常对照组低,尤其在第二周到第四周。而这段时间是突触形成和功能成熟的关键时期,大约有90%的突触在这段时间发育成熟。而且,虽然VPA孤独症模型成年大鼠PV的表达量与对照组无差异,但是Golgi染色示神经元及神经纤维均出现形态学异常。所以,我们认为孤独症模型大鼠发育过程中情绪与认知相关脑区内PV的表达变化可能影响了突触的正常发育与功能成熟。综上所述,PV阳性神经元在孤独症模型大鼠脑内发生了明显的变化。作为CNS一种重要的GABA能神经递质,PV的正常发育对于突触的形成和功能成熟具有重要的意义。我们认为:PV在突触形成和功能成熟的关键时期出现表达的异常,严重地影响突触的正常形成和功能的成熟,导致兴奋性突触与抑制性突触的失衡,后者引起这些脑区信息传递的紊乱,继而导致整个脑功能的失常和孤独症的发生。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分:成年RCS和VPA孤独症模型大鼠情绪与认知相关脑区PV阳性神经元的表达
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:VPA孤独症模型大鼠情绪与认知相关脑区发育过程中PV的表达变化
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 文献综述
• 附件
• 致谢