山东省鸡肾型IBV的分离鉴定及其核蛋白基因的遗传变异分析

论文摘要

本研究在2006—2007年从山东省分离到10株肾型IBV,并通过电镜形态观察、致鸡胚矮小化试验、病毒干扰试验、血凝试验、动物回归试验以及分子生物学试验等方法对其进行了鉴定,同时对病毒基因组中的核蛋白基因序列进行了测定、分析和比较,以说明山东省肾型IBV毒株之间以及与参考毒株之间基因的遗传变异情况,同时构建系统进化树,分析山东省肾型IBV分离株与参考株之间的系统进化关系,探讨山东省肾型IB流行的背景和原因。现地濒死病鸡病变组织处理后接种9～11日龄SPF鸡胚,接种鸡胚后72h内收集尿囊液,同时观察胚体病变。传3～7代后,发现死亡鸡胚表现出生长发育障碍（侏儒胚）,胚体弥漫性出血,尤其是头部出血比较明显,未死亡鸡胚呈现典型的卷曲胚。病毒尿囊液对鸡外周血红细胞无凝集活性。病毒尿囊液在电镜下表现为病毒粒子大多呈球形,直径约为80～120nm,有囊膜,表面有松散、均匀排列的冠状突起,呈现典型的冠状病毒特征,而且未发现有其它病毒粒子的存在。病毒干扰试验可见其能明显干扰NDV在鸡胚中的增殖。未经任何处理的10株分离株病毒对10mL/L的鸡红细胞无血凝活性,而经Ⅰ型磷脂酶C处理后10株分离株病毒对鸡红细胞具有血凝活性。从10株分离病毒的SPF鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,经RT-PCR扩增后将产物电泳,均获得了1600bp左右的核酸片段,与当初设计引物所要扩增的IBV基因片段大小一致,所以可以断定本研究所分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。回归动物后,均表现为肾肿胀、有尿酸盐沉积,形成“花斑肾”,因而确认从山东省分离到的这10株病毒为肾型IBV。应用RT-PCR方法对从山东省分离鉴定到2006—2007年间的10株肾型IBV核蛋白基因序列进行了克隆、测定及分析,结果表明,这些毒株核蛋白基因的核苷酸序列由1230 bp组成,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,与Beaudette株相应区域基因序列长度一致。10株肾型IBV分离毒株之间相比,N基因核苷酸及推导氨基酸的同源性分别为84.6%～99.7%和86.6%～99.8%,与参考毒株N基因核苷酸及推导氨基酸的同源性分别为84.1%～98.9%和86.1%～98.5%。进行序列比较后发现,山东省大部分肾型IBV分离株的核蛋白基因的核苷酸序列存在广泛的基因突变现象,这可能是造成山东省肾型IBV分离株基因组发生变异的主要原因之一。根据本研究从山东省分离鉴定到2006—2007年间的10株肾型IBV病毒与我国其他IBV分离株、我国常用疫苗株以及国外参考毒株绘制的系统进化树发现,从山东省分离到10株肾型IBV具有两个大的基因进化群。SD0605和SD0608属于基因I型,其中主要是Mass血清型毒株,包括美国、荷兰、澳大利亚、日本等国家的IBV代表性毒株以及国内的肾型IBV代表毒株。SD0605 N基因与中国广东IBV肾型疫苗株D41以及H120同源性最高,核苷酸及推导氨基酸同源性均分别为98.9%和98.5%;SD0608 N基因与中国广西肾型毒株GX2的同源性最高,核苷酸及推导氨基酸同源性分别为94.9%和95.6%。这提示SD0605和SD0608的存在可能与山东省长期使用弱毒疫苗有关,存在基因重组现象。其余的八株分离株病毒属于基因Ⅱ型,其中主要是广东肾型IBV毒株GDS14和新疆肾型IBV毒株LX4,以及山东的IBV分离株QXIBV,与我国常用弱毒疫苗株如H120、H52等关系较远。以上结果说明山东省肾型IBV毒株与我国其他地方的肾型IBV毒株关系比较近,现有的疫苗可以对部分毒株起到一定的预防作用,但对于SD0702这种变异如此大的毒株可能很难有效预防,有必要继续跟踪研究山东省的肾型IBV流行情况,并在此基础上进行新型疫苗的研制和制定有效的肾型IBV防控措施。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 引言
• 1 鸡传染性支气管炎概述
• 2 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展
• 2.1 鸡传染性支气管炎病毒生物学分类地位
• 2.2 鸡传染性支气管炎病毒粒子结构及基因组
• 2.2.1 鸡传染性支气管炎病毒粒子结构
• 2.2.2 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构
• 2.3 鸡传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白及其复制
• 2.3.1 鸡传染性支气管炎病毒编码蛋白及生物学功能
• 2.3.2 鸡传染性支气管炎病毒的转录复制
• 3 鸡传染性支气管炎流行病学研究概况
• 3.1 鸡传染性支气管炎病毒的分子变异
• 3.1.1 鸡传染性支气管炎病毒分子变异研究的目的基因
• 3.1.2 鸡传染性支气管炎病毒分子变异机制
• 3.2 鸡传染性支气管炎国内外的流行情况
• 3.2.1 国外IB 流行情况
• 3.2.2 国内IB流行情况
• 4 研究目的和意义
• 试验一 10株鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病料的收集
• 1.1.2 SPF 鸡胚、SPF 雏鸡及鸡外周血红细胞
• 1.1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.1.5 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 病料处理
• 1.2.2 病毒的增殖
• 1.2.3 病毒形态学观察
• 1.2.4 致鸡胚矮小化试验
• 1.2.5 病毒干扰试验
• 1.2.6 血凝试验
• 1.2.7 半数鸡胚感染量（EID50）测定
• 1.2.8 动物回归试验
• 1.2.9 病毒RNA 的提取（Trizol 法）
• 1.2.10 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 1.2.11 琼脂糖凝胶电泳分析
• 2 结果
• 2.1 IBV 的形态学观察
• 2.2 致鸡胚矮小化试验
• 2.3 病毒干扰试验
• 2.4 血凝试验
• 2.5 半数鸡胚感染量（EID50）测定结果
• 2.6 动物回归试验
• 2.7 N 基因的扩增及电泳结果
• 3 结论与讨论
• 试验二 鸡肾型IBV山东分离株核蛋白基因的遗传变异分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 SPF 鸡胚
• 1.1.3 载体与受体菌
• 1.1.4 主要试剂及试剂盒
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.1.6 溶液配制
• 1.1.7 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒的扩增
• 1.2.2 病毒RNA 的提取（Trizol 法）
• 1.2.3 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析
• 1.2.5 PCR 产物的回收
• 1.2.6 IBV N 基因的克隆
• 1.2.6.1 PCR产物与载体的连接
• 1.2.6.2 感受态细胞的制备——氯化钙法
• 1.2.6.3 连接产物的转化
• 1.2.7 重组质粒的提取与鉴定
• 1.2.7.1 重组质粒的提取
• 1.2.7.2 重组质粒的PCR 鉴定
• 1.2.8 重组阳性质粒的序列测定
• 1.2.9 N 基因核苷酸及其推导氨基酸序列的比较分析
• 2 结果
• 2.1 IBV 各分离毒株N 基因的序列确定
• 2.2 IBV 分离株N 基因序列比较分析
• 2.3 IBV 分离株N 基因序列同源性
• 2.4 N 蛋白3 个保守碱性氨基酸区的序列分析
• 2.5 IBV分离株N基因核苷酸及其推导的氨基酸系统进化树分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介及攻读学位期间发表论文情况