糖原合酶激酶-3β对卵巢癌细胞增殖和化疗敏感性的影响及雌、孕激素对其调节作用

论文摘要

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，尽管近年来手术和联合化疗已经取得很大进展，但是由于其发病机制至今尚不清楚，束缚了新疗法的开发，再加上棘手的化疗耐药问题，因而卵巢上皮性癌的5年生存率一直未能提高。许多恶性肿瘤都有一个共有的特征：葡萄糖代谢率的升高。大量葡萄糖的分解代谢不仅可以为肿瘤的快速生长提供能量，而且可以为肿瘤细胞合成DNA、RNA和脂类提供前体物质，因而肿瘤细胞中常存在糖代谢相关酶类的活性异常。其中糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）兼有调节葡萄糖代谢和调节其它转录因子、结构蛋白活性等多种功能，故引起研究者们对其与肿瘤发展关系的广泛研究。但是研究结论却不一致，存在着不同的观点。有关GSK-3β与卵巢癌的研究，更是鲜见报道。本课题从细胞增殖的角度入手，用体外和体内实验，从细胞生长曲线、BrdU掺入率、细胞克隆形成能力和裸鼠成瘤实验四个不同的方面来观察GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞的短期和长期影响；并通过检测细胞周期和细胞周期蛋白表达的变化以初步探讨GSK-3β影响卵巢癌细胞增殖的机制；同时观察提高GSK-3β活性对卵巢癌细胞的化疗增敏作用；最后，探讨了在卵巢癌发生发展过程中有重要影响的雌、孕激素对GSK-3β活性的调节作用。我们的实验结果提示GSK-3β可以影响卵巢癌细胞的增殖和化疗敏感性，雌激素和孕激素可调节卵巢癌细胞GSK-3β的活性。本课题共分三部分：（1）GSK-3β对卵巢癌细胞增殖的影响；（2）GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究；（3）雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用。第一部分糖原合酶激酶—3β对卵巢癌细胞增殖的影响目的探讨糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）对卵巢癌细胞增殖的影响。方法以蛋白免疫印迹法检测总GSK-3β和丝氨酸9位点磷酸化的GSK-3β(pGSK-3βSet9)在卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2中的表达水平；采用细胞计数法描记细胞生长曲线，以检测GSK-3β抑制剂对SKOV3和ES-2细胞生长的影响；将SKOV3细胞分成4组，将增加GSK-3β活性的质粒GSK-3βS9A和其空载对照质粒pCS2以及降低GSK-3β活性的质粒GID5-6和其对照质粒GID5-6LP，分别用电转法与绿色荧光蛋白（GFP）质粒，共同转染入细胞中，采用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）掺入实验检测GSK-3β活性对卵巢癌细胞增殖的影响；利用G418筛选瞬时转染的SKOV3细胞得到稳定转染株后，采用克隆形成实验，观察改变GSK-3β的活性对卵巢癌细胞增殖的长期影响。用GSK-3β抑制剂LiCl或对照NaCl处理SKOV3细胞后，分别注射于裸鼠皮下，每只裸鼠注射5×106个细胞，3周后处死裸鼠，取瘤称重并用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，计算肿瘤体积。结果SKOV3和ES-2细胞均表达GSK-3β和pGSK-3βSer9，SKOV3细胞中pGSK-3βSer9的表达水平比ES-2低，而两者总GSK-3β的表达水平相似。GSK-3β抑制剂可抑制SKOV3和ES-2细胞的生长。与对照pCS2相比，转染GSK-3βS9A质粒以上调GSK-3β的活性，可增加SKOV3细胞BrdU的掺入率；相反，与其对照GID5-6LP相比，转染GID5-6质粒来下调GSK-3β的活性，可减少SKOV3细胞BrdU掺入率。分别与各自的对照质粒相比，稳定转染GSK-3βS9A可形成较多的细胞克隆，而稳定转染GID5-6则形成的细胞克隆较少。与对照NaCl相比，LiCl可抑制SKOV3细胞在裸鼠体内的生长。结论GSK-3β具有促进卵巢癌细胞增殖的作用，抑制GSK-3β的活性可减少卵巢癌细胞的增殖。第二部分GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究目的探讨GSK-3β调节卵巢癌细胞增殖的机理及其对化疗敏感性的影响。方法以电转法将提高GSK-3β活性的GSK-3βS9A质粒和降低GSK-3β活性的GID5-6质粒及其相关对照质粒与绿色荧光蛋白（GFP）质粒共同转染入卵巢癌细胞株SKOV3中，用流式细胞仪进行荧光分选，检测转染了上述质粒的细胞所处的细胞周期；用蛋白免疫印迹法检测转染上述质粒对细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响：采用碘化丙啶（PI）染色及荧光显微镜下观察死亡细胞法筛选泰素敏感实验的适合浓度(即24h IC10)；以GSK-3βS9A质粒和对照质粒转染SKOV3细胞后，用适当浓度的泰素处理细胞24h，采用PI染色并于荧光显微镜下计数死亡细胞数，检测泰素作用的敏感性。结果转染GSK-3βS9A质粒，提高GSK-3β活性后，有45.5±1.7％的SKOV3细胞进入S期，而其转染对照质粒后只有37.5+2.9％的细胞进入S期；相反，转染GID5-6质粒降低GSK-3β活性后，只有26.8+2.1％的SKOV3细胞进入S期，而转染对照质粒后进入S期的细胞百分比为36.3+1.5％，差异有统计学意义（P＜0.05）。转染GSK-3βS9A质粒可上调细胞周期蛋白cyclin D1的表达，而转染GID5-6质粒可下调cyclin D1的表达。泰素作用24 h的IC10为0.01μmol／L，用该浓度的泰素分别处理转染了GSK-3βS9A质粒及其对照质粒的SKOV3细胞，PI染色显示转染GSK-3βS9A的细胞经泰素处理24h后，有27.2+4.1％死亡，而转染对照质粒的细胞经处理后，只有12.8+0.8％的细胞死亡，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论GSK-3β可通过上调cyclin D1的表达水平，促进SKOV3细胞进入S期，从而使卵巢癌细胞增殖。提高GSK-3β活性可增加SKOV3细胞对泰素的敏感性。第三部分雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用目的探讨雌激素和孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用。方法用含有10％活性炭处理的胎牛血清的无酚红RPMI-1640培养基，预处理SKOV3细胞3天。将10-8mol／L、10-7mol／L或10-6mol／L的17-β雌二醇或醋酸甲羟孕酮孵育SKOV3细胞，以DMSO为对照，48h后用蛋白免疫印迹法检测总GSK-3β和丝氨酸9位点磷酸化的GSK-3β(pGSK-3βSer9)的表达水平。然后用10-6mol／L的17-β雌二醇或醋酸甲羟孕酮，处理24h、48h或72h后检测总GSK-3β和pGSK-3βSer9的表达水平。结果经预处理后，17-β雌二醇可下调SKOV3细胞pGSK-3βSer9的表达水平，并随着剂量的加大和时间的延长，作用愈明显。相反，醋酸甲羟孕酮孵育后SKOV3细胞pGSK-3βSer9的表达水平上升，并随着剂量的加大和时间的延长，作用更加显著。而总GSK-3β的表达水平没有明显变化。结论雌激素可下调pGSK-3βSer9的表达水平，从而提高GSK-3β的活性，孕激素则可通过上调pGSK-3βSer9的表达水平而降低GSK-3β的活性，并且具有时间和剂量依赖性效应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 糖原合酶激酶—3β对卵巢癌细胞增殖的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 研究生期间投稿的论文
• 致谢