猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03株分离鉴定

论文摘要

采用传代细胞（非洲绿候肾细胞）从猪腹泻粪便中分离出1株猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） ,命名为PEDV LJB/O3株。该病毒接种Vero细胞时,在其维持液中加入3μg/ml胰酶,通过稳定的细胞病变、病毒的TCID50测定、RT-PCR扩增试验、间接免疫荧光试验、间接ELISA试验等方法对该分离毒进行了鉴定。实验结果表明:病毒盲传20代,未出现明显的病变,第21代48h出现可见CPE, 72h收获病毒液。随着传代代数的增加,出现CPE的时间缩短,细胞病变程度亦随之加剧。该毒株传到40代时,接种病毒的细胞产生规律性病变,病毒培养24h,细胞肿胀变圆,折光性增强,颗粒物质增多;培养36h,细胞大量脱落崩解,细胞间隙变大;培养48h,细胞脱落达到80%,细胞拉成网状,而对照细胞直到培养48h还保持致密的单层,呈长梭形,轮廓清晰,细胞脱落极少。为进一步证明这种病变是由PEDV所引起以及病毒在细胞中得以繁殖,本实验以每隔10个代次采用RT-PCR技术扩增PEDV M基因,对第1、10、20、30和40不同代次的细胞培养物进行的RT-PCR检测,结果均为阳性。间接免疫荧光实验结果表明,经PEDV感染40h后的Vero细胞,在细胞中检测到病毒抗原的存在,可见绿色荧光,而未被PEDV感染的Vero细胞中,看不见任何绿色荧光。间接ELISA检测,P/N平均比值为7.6,判断此细胞培养毒为阳性。对第40代病毒测定TCID50结果为10-5.2/0.1 mL。由以上的试验可以证明从粪便里分离出的这株病毒为猪流行性腹泻病毒,且此病毒能在含有胰酶维持液的Vero细胞培养物上生长繁殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 PED 爆发简史
• 1.2 猪流行性腹泻病毒的生物学特性研究
• 1.2.1 病毒形态特征及理化特性
• 1.2.2 主要结构基因及其编码蛋白的功能特性
• 1.2.3 PEDV 与其它冠状病毒的抗原相关性
• 1.2.4 PED 诊断方法研究进展
• 1.2.5 病毒感染特性的研究
• 1.3 本实验研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病料
• 2.1.2 细胞
• 2.1.3 实验中用到的引物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 其它主要试剂
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.1.7 试验抗体
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PEDV 感染样品的制备及鉴定
• 2.2.2 PEDV 分离鉴定
• 3 结果
• 3.1 PEDV 感染样品的鉴定
• 3.2 病毒的培养
• 3.3 分离毒RT-PCR 检测结果
• 50测定结果'>3.4 分离毒TCID₅₀测定结果
• 3.5 间接免疫荧光检测结果
• 3.6 间接ELISA 检测结果
• 3.7 M 基因序列分析
• 4 讨论
• 4.1 有关PEDV 的细胞培养
• 4.2 PEDV LJB/03 毒株在Vero 细胞上的培养特性
• 4.3 用RT-PCR 技术检测LJB/03 在Vero 上稳定传代
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的学术论文