蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1催化结构域的克隆表达及抑制剂筛选

论文摘要

蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）大家族,是信号转导中的重要调节因子,与人类疾病密切相关。SHP-1是主要表达于造血细胞的酪氨酸磷酸酶,其基因位于第12号染色体的p12-p13区,全长17Kb。本文以人蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1基因为模板,克隆了SHP-1的催化结构域（△SHP-1）基因,并连接在表达载体pT7上,将重组体pT7-ΔSHP-1质粒转化到E.coil DE3细胞中进行高效表达,通过Q-Sepharose Fast Flow和SP-Sephadex两步离子交换柱层析,分离纯化得到纯度﹥90%的△SHP-1蛋白纯品。对ΔSHP-1的酶学性质研究表明,当底物为p-NPP时,ΔSHP-1的最适pH为5.0,最适反应温度为36℃,最适离子强度为0;对其进行酶促反应进行动力学分析,得出Km=23.75mM,Vmax=8.882μmol/min。应用蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的催化结构域（ΔSHP-1）为靶标,通过体外酶反应动力学实验,从大量的中药中筛选出两种对其有明显抑制作用的中药:中药A和中药B,它们对?SHP-1的IC50分别为2ug/ml和4ug/ml,而且通过动物实验,证明这两种中药对II型糖尿病模型小鼠均具有显著的降血糖作用。实验结果表明,中药A和中药B有可能通过抑制体内SHP-1的活性,从而降低了II型糖尿病模型小鼠的血糖。采用靶标进行药物筛选,是创新药物的研究方法之一,药效确切、机理清晰、质量标准可靠,具有特异性和准确性,也可以发现原有药物的新用途,从而实现中药产品的二次开发。本研究为寻找有效的中药降糖药物奠定了基础,也为中药A和中药B在治疗II型糖尿病中的应用提供了理论依据。

论文目录

• 提要
• 第一篇 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1 催化结构域的克隆表达及多克隆抗体制备
• 第一章 前言
• 第一节 蛋白质酪氨酸磷酸化概述
• 第二节 蛋白质酪氨酸磷酸酶及其相关疾病
• 第三节 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1 概述
• 参考文献
• 本篇设计构想
• 第二章 SHP-1 基因催化结构域的克隆表达
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三节 结果与讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 ΔSHP-1 的分离纯化及酶学表征
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三节 结果与讨论
• 小结
• 第四章 ΔSHP-1 多克隆抗体的制备及纯化
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三节 结果与讨论
• 小结
• 参考文献
• 总结
• 第二篇 从中药中筛选蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1 的抑制剂
• 第一章 前言
• 第一节 胰岛素作用相关的蛋白质酪氨酸磷酸酶
• 第二节 蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂
• 第三节 糖尿病概述
• 第四节 中药在治疗糖尿病中的应用
• 参考文献
• 本篇设计构想
• 第二章 △SHP-1 中药抑制剂的筛选
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三节 实验结果与讨论
• 小结
• 第三章 中药对Ⅱ型糖尿病模型小鼠降血糖作用的研究
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三节 实验结果
• 小结
• 总结
• 攻博期间发表的学术论文
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢