落叶松种间、无性系及杂种家系ISSR鉴别技术的研究

论文摘要

本研究以中国北方地区的主要造林及用材树种落叶松为研究对象,利用黑龙江青山林场的落叶松种子园、收集区和子代测定林内的日本落叶松、兴安落叶松、长白落叶松的无性系及其控制授粉子代的当年生嫩叶材料,采用ISSR分子标记技术对落叶松进行不同物种间、无性系间、杂种子代与亲本、杂交组合间等家系间的鉴别。并对不同种和杂交组合扩增出的物种特异片段进行回收测序,转化为SCAR引物,为落叶松的鉴别提供了新的分子鉴定方法,为将来开展落叶松杂种优势机理研究奠定了基础。1.从488引物中共筛选出49个ISSR引物对所有样品进行扩增,得到鉴别日本落叶松的ISSR引物2个,分别是ISSR12和ISSR32,兴安落叶松的引物1个为ISSR18,长白落叶松的引物2个,分别是ISSR38和ISSR41。鉴定兴安落叶松×长白落叶松杂种的ISSR引物1个为ISSR16,日本落叶松×长白落叶松的引物1个为ISSR19。2.有22个无性系可以通过9个引物扩增的不同片段进行一次性区分鉴定,其他无性系的鉴别可以利用多个引物扩增谱带的差异进行区别。在0.52的遗传距离上,可以将34个无性系分为3种,分别是日本落叶松、长白落叶松和兴安落叶松。3.利用ISSR分子标记从杂种子代与亲本、正反交家系和亲本之一相同的不同家系的鉴别三个不同的方面对落叶松杂种家系进行了鉴定。鉴别不同家系的杂种与亲本时,可以与亲本区别的子代的目的片段的扩增率在90%以上;根据扩增片段出现的比率可以对正反交家系进行鉴定,目的片段在正交与反交间存在的差异在80%以上;已知一种亲本时,可以通过扩增目的片段出现的比率计算另一种亲本的可能性。在0.4的遗传距离上可以将家系分成4类,即日×兴、日×长、兴×长和兴×日四种杂交组合。4.将7个ISSR引物扩增的特异片段回收、克隆后进行测序,根据测序结果特异片段的序列设计成对的SCAR引物,经过验证得到3对适合应用的SCAR特异引物分别是SC18s/SC18a;SC16s/SC16a;SC19s/SC19a。本研究为落叶松的鉴别工作提供了高效、可靠的鉴别方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 落叶松的研究现状
• 1.1.1 落叶松的简介
• 1.1.2 落叶松的经济价值
• 1.1.3 落叶松遗传改良概况
• 1.1.4 落叶松鉴别研究概况
• 1.2 分子标记方法在林木中的应用
• 1.2.1 几种分子标记的特点
• 1.2.2 ISSR（简单重复序列中间区域标记）
• 1.2.3 SCAR（序列特征扩增区域）
• 1.2.4 应用分子标记进行遗传距离分析
• 1.3 本项研究的目的和意义
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料及仪器、试剂
• 2.1.1 试验材料来源
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂及配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 落叶松基因组DNA的提取与检测
• 2.2.2 落叶松ISSR-PCR反应体系及引物筛选
• 2.2.3 ISSR特异片段的回收
• 2.2.4 ISSR特异片段的克隆
• 2.2.5 ISSR特异片段的测序及SCAR引物的设计
• 2.2.6 遗传距离分析
• 3 结果与分析
• 3.1 DNA提取
• 3.2 引物的筛选
• 3.3 ISSR标记种间鉴定
• 3.4 ISSR标记无性系鉴定
• 3.4.1 无性系鉴别
• 3.4.2 无性系间遗传距离分析
• 3.5 ISSR标记杂种组合间鉴定
• 3.6 ISSR标记杂种家系的鉴定
• 3.6.1 杂种子代与亲本的鉴别
• 3.6.2 正反交家系的鉴别
• 3.6.3 双亲之一相同的不同家系的鉴别
• 3.6.4 家系间遗传距离分析
• 3.7 SCAR标记检测
• 3.7.1 目的片段的获取、连接及转化
• 3.7.2 扩增片段测序结果及引物设计
• 3.7.3 SCAR引物检测结果
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢