论文摘要
中枢神经系统损害的干细胞干预是目前国内外广泛关注的创伤治疗新策略,它极有可能为颅脑创伤后的神经修复治疗带来新的曙光。然而,干细胞治疗的安全性和有效性仍是目前制约其进一步发展的瓶颈。如何在利用干细胞修复神经损害的同时避免其迅速衰老、向肿瘤细胞分化等不良后果,这是目前此类研究亟待解决的问题。与神经干细胞（NSCs）相比,骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其不受伦理学方面的限制,来源方便,近几年更多地被研究人员采纳。研究显示,BMSCs具有自我更新能力和多向分化潜能。BMSCs在体内或体外诱导条件下可向神经细胞分化,还能分泌多种神经营养因子,可作为中枢神经系统移植治疗的种子细胞。然而一直有研究发现BMSCs在长期体外培养中经常出现增殖,分化能力丧失,过早老化等现象,使其生存时间受限的同时,影响移植细胞的数量和质量,制约干细胞移植治疗的开展。为了克服这个限制,我们通过向rBMSCs转染阳离子脂质体介导的人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptasehTERT）表达载体来增强端粒酶的活性。并因此建立了rBMSCs永生化细胞系。由于端粒酶的增强表达经常是许多肿瘤的特征,我们通过米非司酮调控的pGeneSwitch-V5-His-hTERT系统进一步上调rBMSCs中端粒酶的活性,在体内外,对端粒酶永生化的rBMSCs从形态学,生物学特性、成瘤可能性以及神经细胞方向分化等几个方面进行了研究。进一步评估端粒酶永生化BMSCs的安全性及可靠性,为端粒酶永生化BMSCs的临床应用奠定基础。本研究分三部分。第一部分我们使用当前较为成熟的原代贴壁培养法获得rBMSCs,以流式细胞术鉴定其表面标记抗原予,结果符合BMSCs特征,证实rBMSCs培养成功。同时我们在体外对rBMSCs的成骨、脂肪及神经细胞方向的分化潜能进行了初步研究。结果显示rBMSCs易于提取、纯化和扩增,其在体外能自发表达神经干细胞相关蛋白并可通过诱导向脂肪,成骨及神经细胞分化。提示其具有多向分化潜能的同时可能具有自发向神经干细胞分化的特性。第二部分,在体外建立端粒酶永生化rBMSCs细胞系,并研究端粒酶永生化rBMSCs成瘤的可能性。我们分别向第五代rBMSCs转染pLXSN-S-hTERT以及共转染通过米非司酮调控的重组表达质粒pGene/V5-His-hTERT和调控质粒pSwitch。应用RT-PCR、Western Blot等技术检测转染结果及端粒酶活性。使用流式细胞仪、MTT等方法检测实验组细胞生物学特性及生长情况。通过血清依赖实验、软琼脂克隆试验、流式细胞仪细胞周期检测、Western Blot体外检测实验组细胞的成瘤倾向。结果转染组细胞端粒酶活性明显增高,并表现出良好的永生化特征。流式细胞术鉴定显示转染组细胞符合BMSCs特征。MTT比色实验显示实验组细胞保持了良好的增殖能力。血清依赖实验、软琼脂克隆试验、细胞周期检测结果均未发现成瘤倾向。Western Blot分析发现c-Myc在各组细胞中的表达无明显差异。结果提示端粒酶永生化rBMSCs在体外尚不具备成瘤性,转染正义hTERT载体可作为建立BMSCs永生化细胞系的安全手段。第三部分,在体内进一步对端粒酶永生化rBMSCs的成瘤可能性及其神经细胞方向自发分化潜能进行了研究。我们先成功的制备了大鼠中度液压冲击脑损伤模型,然后我们分别将rBMSCs、pLXSN-hTERT-rBMSCs、米非司酮持续诱导pGeneSwtch-V5-His-hTER-rBMSCs组细胞植入正常及脑损伤SD大鼠项叶皮质,同时种植于裸鼠左侧腹股沟皮下组织内,通过对移植区脑组织HE染色及对裸鼠的细胞移植区皮肤的观察检测其成瘤性。同时将Hoechst33258标记的rBMSCs和永生化pLXSN-hTERT-rBMSCs植入正常及脑损伤SD大鼠顶叶皮质,用免疫荧光的方法检测移植部位神经标志蛋白表达,计数移植存活细胞并进行统计分析。结果显示:大鼠脑内移植部位及裸鼠皮下均未见肿瘤生长。大鼠脑内移植区免疫荧光检测可见部分Hoechst 33258标记细胞神经标志蛋白表达呈阳性。无论在正常还是脑损大鼠的顶叶移植区内,端粒酶永生化rBMSCs Hoechst33258标记的存活细胞数明显高于单纯BMSCs（F=57.888,P＜0.05）。结果提示,端粒酶永生化大鼠BMSCs移植到正常及脑损伤大鼠脑内后存活良好,并可表达神经细胞标志蛋白,同时细胞在植区的存活数量明显高于单纯rBMSCs。即rBMSCs的分化方向受体内环境的影响而且外源性hTERT表达会增加移植细胞的存活率。端粒酶永生化rBMSCs在体内不具有成瘤倾向。上述试验结果提示:端粒酶永生化rBMSCs不具备成瘤倾向,提高端粒酶活性对BMSCs的增殖起促进作用。转染正义hTERT载体可作为建立BMSCs永生化细胞系的安全手段。端粒酶永生化的BMSCs有希望成为创伤脑组织干细胞治疗的安全而有效的种子细胞或工具细胞。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 端粒酶逆转录酶催化亚单位论文; 永生化肿瘤论文;