猪肝组织中喹赛多作用基因的发现与鉴定

论文摘要

喹噁啉-1,4-二氧化物是具有广谱抗菌和促生长双重功效的动物专用药物,自上个世纪70年代以来被广泛应用于养殖业。其代表品种有卡巴氧和喹乙醇,主要作为饲料添加剂用于食品动物。近年来,因对动物具有不同程度的毒副作用而被禁用或被严格限制使用。因此,开发毒副作用更低的本类替代产品具有重要意义。喹赛多是喹噁啉-1,4-二氧化物的一个新品种,保留了喹噁啉-1,4-二氧化物的广谱抗菌和促生长作用,并且具有毒副作用小、安全性高、用药后吸收快、消除迅速、残留期短、无积蓄作用等优点。目前其作用机制仍不十分清楚。mRNA差异显示技术自建立以来作为一种鉴定和分析真核细胞mRNA水平基因表达差异的有效方法,得到不断的完善和发展,目前已成为寻找由于药物作用、细胞发育、肿瘤发生等相关的差异基因的首选方法。本实验应用mRNA差异显示技术,研究在喹赛多作用下猪肝脏组织中差异表达的基因,探讨喹赛多作用分子机制,寻找喹赛多作用的生物标志物。本实验将18头断奶仔猪随机分为3组,每组6头,分别为空白对照组、喹赛多100mg/kg饲料组、喹赛多500mg/kg饲料组,实验期为21天。猪只屠宰后立即采取肝脏组织,放液氮速冻后转到-80℃冰箱保存。应用Trizol试剂从猪肝脏组织中提取总RNA,并用DNaseⅠ消化除去RNA中可能存在的痕量DNA,以降低假阳性的发生率。运用琼脂糖凝胶电泳和紫外可见分光光度法鉴定RNA质量和纯度。反转录后,采用改进的差异显示锚定引物和随机引物进行扩增,运用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染的方法,多次重复分离筛选差异条带。用改进的方法回收差异条带,并进行二次扩增。PCR产物纯化后与质粒载体pMD18-T Simple Vector连接,转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆。质粒酶切和菌液PCR鉴定阳性克隆并测序,获得差异基因片段的DNA序列。采用Northern斑点杂交和反向Northern斑点杂交技术相结合的方法,并运用分子生物学软件Image-pro plus 6.0对显色结果进行灰度值计算,对获得的差异显示片段进一步鉴定。将所得喹赛多作用相关差异基因的DNA序列,通过BLAST工具分别对GenBank数据库中猪、人、小鼠和牛的核苷酸序列和蛋白质数据库中的氨基酸序列进行同源性分析和开放阅读框（ORF）分析。结果显示,喹赛多可显著提高仔猪平均日增重（p＜0.01）,临床推荐剂量的10倍剂量（500mg/kg饲料组）没有发现任何毒性症状。实验最终得到8条与喹赛多作用相关的差异基因。其中5条基因A-3-4、A-4-4、A-6-2、G-1-1和G-6-1的表达量与喹赛多剂量呈正相关,分别与GenBank数据库中猪表皮生长因子、人类锌指结构、猪的抗细胞衰亡因子1、猪胰岛素样生长因子-Ⅰ和猪C3补体成分基因序列高度同源。1条基因C-7-1的表达量与喹赛多剂量呈负相关,在数据库中未搜索到高度同源的基因和EST,其编码的蛋白质在蛋白质数据库中也未搜索到高度同源的蛋白质,可能是没有被研究过的猪的新基因。2条基因C-3-2和C-5-1表达量上调,但随着喹赛多剂量的增加表达量不变,分别与GenBank数据库中猪转酮醇酶和牛ADP聚合酶基因序列高度同源。本文采用mRNA差异显示技术对喹赛多不同剂量组猪肝脏差异表达基因进行研究尚属首次,并发现喹赛多可调节锌指结构和诸多生长相关、免疫相关、代谢相关因子和酶的表达。锌指结构是生物体内重要的调控转录和翻译的结构域,结合各生物标志物的功能,推测喹赛多的促生长机制可能是通过对锌指结构的调控,调节表皮生长因子、胰岛素样生长因子-Ⅰ、抗细胞衰亡因子1等生长相关因子的表达量以促进动物生长发育;调节C3补体成分的表达量以发挥其在免疫防御和免疫调控中的重要作用;调节磷酸戊糖途径的关键酶转酮醇酶的表达量以提高磷酸戊糖途径的代谢活力,促进核酸、蛋白质合成;调节ADP-核糖聚合酶的基因表达量促进DNA的复制、修复和蛋白质表达后修饰。本实验发现并鉴定了喹赛多作用相关基因,从基因水平上说明了喹赛多对动物生长、免疫和代谢的良好促进作用。并根据相关基因的功能,分析推测喹赛多在动物体内作用的可能路径。深入研究的思路可针对各因子表达和调控相互之间的联系,进一步阐明喹赛多作用的分子机制,从而发现更多与促生长相关的调控机制和作用方式,为其他抗菌促生长药物的机制研究提供思路,或开发生物技术药物,用于动物养殖,推动畜牧业快速发展。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 喹赛多研究进展
• 1.2 mRNA差异显示技术
• 1.3 研究内容和目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 药品与试剂
• 2.2 仪器设备
• 2.3 引物序列
• 2.4 动物
• 2.5 统计分析
• 2.6 猪肝脏组织总RNA提取
• 2.7 DNase Ⅰ处理
• 2.8 RNA质量纯度鉴定与浓度测定
• 2.9 cDNA第一链的合成
• 2.10 cDNA质量鉴定
• 2.11 差异显示PCR
• 2.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.13 银染
• 2.14 从PAGE胶回收DNA
• 2.15 二次扩增
• 2.16 回收纯化DNA
• 2.17 目的基因克隆与鉴定
• 2.17.1 感受态细胞制备
• 2.17.2 基因克隆
• 2.17.3 阳性克隆鉴定
• 2.18 Northern杂交及软件分析
• 2.19 反向Northern杂交及软件分析
• 2.20 阳性差异基因片段同源性比对分析
• 3 结果
• 3.1 喹赛多对猪生长性能的影响
• 3.2 总RNA提取
• 3.3 差异显示PCR结果
• 3.4 二次扩增
• 3.5 阳性克隆鉴定
• 3.6 Northern杂交
• 3.6.1 探针标记效率鉴定
• 3.6.2 杂交显色及软件分析
• 3.7 反向Northern杂交
• 3.7.1 探针标记效率检测
• 3.7.2 杂交显色及软件分析
• 3.8 差异基因鉴定
• 3.9 差异基因序列及分析
• 3.9.1 基因A-3-4序列及分析
• 3.9.2 基因A-4-4序列及分析
• 3.9.3 基因A-6-2序列及分析
• 3.9.4 基因G-1-1序列及分析
• 3.9.5 基因G-6-1序列及分析
• 3.9.6 基因C-3-2序列及分析
• 3.9.7 基因C-5-1序列及分析
• 3.9.8 基因C-7-1序列及分析
• 4 讨论
• 4.1 总RNA的提取
• 4.3 差异显示PCR体系影响因素
• 4.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法
• 4.5 差异条带的回收和二次扩增
• 4.6 喹赛多相关基因
• 4.7 喹赛多作用机制的探讨
• 4.8 深入研究的思路
• 4.8.1 关于喹赛多作用机制的进一步研究
• 4.8.2 关于未知功能基因片段的深入研究
• 5 小结
• 6 文献综述:生物标志物及其在兽医药理学及毒理学的应用
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录
• 对答辩委员意见的答复