东亚钳蝎氯离子通道毒素的生物活性研究

论文摘要

蝎（scorpion）是一种古老的物种,蝎尾部毒腺内储存的蝎毒素不仅是其捕食、御敌的重要器官,也是治疗人类某些疾病的良药。蝎毒素的主要成分是20～90个氨基酸构成的小分子多肽,一般含3～4对二硫键,可以选择性的与动物可兴奋细胞膜上的钠、钾、钙、氯离子通道结合,引起通道电流的阻断或门控动力学的改变。本课题组的前期研究根据大肠杆菌偏爱密码子,优化了东亚钳蝎（Buthusmartrnsii Karsch,BmK）氯离子通道毒素BmK CT基因序列（Accession Number:AF135821）,并将此人工合成的基因命名为BmK CTa。该序列编码的氯离子通道毒素由35个氨基酸组成,含4对二硫键,与从以色列蝎（Leiurus quinquestriatus）中分离得到的氯离子通道毒素chlorotoxin有68%的同源性,推测它们可能具有近似的生物学功能。Chlorotoxin可以选择性的结合并抑制人脑神经胶质瘤细胞上的基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）,从而抑制神经胶质瘤细胞的转移扩散。前期的体外研究表明,rBmK CTa对神经胶质瘤细胞有较强的毒性作用,对神经胶质瘤具有潜在的治疗价值。所以,对BmK CT生物学功能的进一步研究具有一定的理论意义和应用价值。本研究将重组东亚钳蝎氯离子通道毒素rBmK CTa进行原核可溶性表达,并获得较高纯度的rBmK CTa,分析了该毒素对神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力的影响,并研究了它与细胞表面可能的受体蛋白MMP-2的相互作用关系。通过人神经胶质瘤的原位荷瘤裸鼠动物模型观察了rBmK CT在小鼠体内的代谢动力学分布。本研究的主要结果如下:1.建立了rBmK CTa（recombinant BmK CT artifact）的可溶性表达与纯化方法。通过pRSETc表达系统将按照大肠杆菌偏爱密码子优化后的BmK CT基因在大肠杆菌BL21（DE3）中获得表达。Western blot表明,目的蛋白主要以单体形式存在。利用Ni-NTA亲和层析一步纯化得到了纯度较高的单体重组BmK CTa,最终每升培养液中可获得纯蛋白1.5～2.1 mg,为下一步研究其生物学功能奠定了基础。2.分析了rBmK CTa对神经胶质瘤细胞SHG-44的迁移、侵袭能力的影响,并通过细胞免疫组化、明胶酶谱与Western blot方法,分析rBmK CTa作用前后SHG-44细胞中MMP-2的表达及活性变化。结果表明,rBmK CTa可减慢SHG-44细胞的生长与迁移速度,其抑制细胞迁移IC50为0.28μM。同时,rBmK CTa能够抑制在侵袭转移中起重要作用的MMP-2的表达,使MMP-2分泌减少,这种减少呈剂量依赖性趋势。上述结果表明,rBmKCTa通过抑制MMP-2的表达,从而抑制了肿瘤细胞与细胞外基质（ECM）的黏附及ECM的降解,降低了肿瘤细胞迁移能力。流式细胞术分析表明,0.4μM～3.2μM重组BmK CTa作用后,SHG-44细胞G0/G1期所占比例增加,S期所占比例减少,使细胞生长阻滞于G0/G1期。在3.2μM的rBmK CTa作用24 h时,细胞的凋亡率接近50%。结果提示,rBmK CTa对于神经胶质瘤具有潜在的治疗价值,有望成为新型的靶向性药物。3.利用RT-PCR法从SHG-44细胞中克隆得到基质金属蛋白酶2（MMP-2）基因,将其C端的胞外区部分构建入表达载体pExSecI中,并在大肠杆菌中获得表达。MMP-2C主要以包涵体的形式存在,通过变复性和亲和层析,从而获得可溶的MMP-2C蛋白。利用pull down方法确定MMP-2C与rBmK CTa可以在体外相互作用。据此推测,rBmK CTa抑制MMP-2的表达,可能是通过二者的直接相互作用而实现。4.将rBmK CTa的C末端引入2个Tyr残基,并在pExSecI分泌型表达系统中表达ZZ-rBmK CTa-Tyr,通过IgG Sepharose纯化该蛋白。用标准Iodogen法进行ZZ-rBmK CTa的131I标记,纸层析测定放化纯为90%。建立了含人神经胶质瘤的荷瘤鼠模型,经尾静脉和颅内注射分别将17.9μCi和2μCi标记蛋白注入小鼠体内。在注射给药后的10个时间段,通过SPECT观察小鼠体内标记蛋白的动力学分布。结果显示,131I-ZZ-rBmK CTa通过两种给药方式均可快速通过体液循环穿过小鼠的血脑屏障。在给药后24 h,检测标记蛋白在小鼠左脑、右脑、胃、肾脏、脾脏、肝脏、后肢肌肉、肺、心脏等12个器官的分布情况。分析表明,131I-ZZ-rBmK CTa在大脑中的比放射性量,在右脑（肿瘤）处蛋白含量明显高于左脑正常组织,T/NT值分别为1.25和4.13,说明ZZ-rBmK CTa与神经胶质瘤细胞可以特异性结合。以上结果提示,脑神经胶质细胞和神经细胞膜上的某些受体分子对rBmK CTa有较强的亲和性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 蝎神经毒素概述
• 2.1 蝎神经毒素的组成与性质
• 2.2 蝎神经毒素的特征与分类
• 2.3 蝎神经毒素的进化
• 2.4 蝎神经毒素的结构与功能
• 2.5 重组蝎神经毒素的表达
• 2.6 蝎神经毒素的生物活性测定
• 3 蝎氯离子通道毒素与氯离子通道
• 3.1 蝎氯离子通道毒素
• 3.2 神经胶质瘤细胞的氯离子通道
• 4 蝎毒素抗肿瘤作用及可能机制
• 4.1 蝎毒素的抗肿瘤作用
• 4.2 基质金属蛋白酶与神经胶质瘤的侵袭性
• 5 蝎神经毒素在治疗神经胶质瘤中的应用
• 6 本研究的立题背景及意义
• 6.1 研究背景
• 6.2 研究目的、意义及创新点
• 7 参考文献
• 第二章 东亚钳蝎氯离子通道毒素（rBmK CTa）在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 重组表达质粒pRSETc-rBmK CTa的构建
• 3.2 重组菌的诱导表达分析
• 3.3 融合蛋白His-rBmK CTa的纯化
• 3.4 融合蛋白His-rBmK CTa的Western blot分析
• 3.5 目的蛋白表达量的分析
• 4 讨论
• 4.1 BmK CT基因和蛋白的序列分析
• 4.2 rBmK CTa表达及纯化分析
• 5 参考文献
• 第三章 rBmK CTa对神经胶质瘤细胞SHG-44迁移、侵袭能力的影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 rBmK CTa对SHG-44细胞生长的抑制作用
• 3.2 rBmK CTa对SHG-44细胞迁移的影响
• 3.3 rBmK CTa对SHG-44细胞中MMP-2表达活性的影响
• 3.4 rBmK CTa对细胞周期和凋亡的影响
• 4 讨论
• 4.1 神经胶质瘤细胞的生长、侵袭性
• 4.2 神经胶质瘤中MMP-2的表达
• 4.3 蝎毒素rBmK CTa对SHG-44细胞周期的影响
• 5 参考文献
• 第四章 基质金属蛋白酶MMP-2C的表达、纯化及其与rBmK CTa相互作用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 MMP-2基因的克隆
• 3.2 MMP-2C表达载体的构建
• 3.3 ZZ-MMP-2C的诱导表达
• 3.4 ZZ-MMP-2C的变复性和纯化
• 3.5 MMP-2C与rBmK CTa体外相互作用
• 4 讨论
• 4.1 BmK CT对MMP-2作用区域的的分析
• 4.2 BmK CT与神经胶质瘤细胞作用方式的探讨
• 5 参考文献
• 第五章 rBmK CTa在脑原位荷瘤鼠体内的代谢动力学和靶向性分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 重组表达质粒pExSecI-rBmK CTa-Tyr的构建和鉴定
• 3.2 重组蛋白ZZ-rBmK CTa的表达与纯化
• 3.3 ZZ-rBmK CTa的放射性碘标记
• 3.4 ZZ-rBmK CTa在脑原位荷瘤鼠体内的代谢动力学和靶向性分析
• 3.5 脑组织切片病理学检测
• 4 讨论
• 5 参考文献
• 总结与展望
• 总结
• 展望
• 附录Ⅰ 缩略词
• 附录Ⅱ 在读期间发表的论文
• 致谢