红景天促血管生长作用与其组方的比较和机制的研究

论文摘要

冠心病的疾病负荷大，以急性心肌梗死为首发表现者，约1／3发生猝死。大部分冠心病患者采取积极的二级预防治疗可以改善预后。但是仍有部分患者对于常规药物治疗无效而又不适于介入治疗和搭桥手术。这时治疗性血管新生成为一种可能有效的替代手段。治疗性血管新生的重要组成部分之一是中药治疗。中药是我国传统医学重要组成部分，资源丰富。我们科以往对抗心肌缺血中药做了很多研究。我们对一批中药的促血管生长作用进行了比较，并从中筛选出以红景天为代表的5个具有显著促血管生长作用的药物。进一步研究红景天发现它能促使脐静脉内皮细胞的VEGF和FGF的表达增加，促进大鼠梗死心肌边缘的血管生长，VEGFR2表达增加，改善心功能和心室重构。虽然红景天等5味中药均具有促血管生长作用，那么将其组合后是否这种作用会进一步增强呢?红景天促血管生长是否只是通过VEGF和FGF起作用的?这种作用与哪条主要促血管生长的信号传导通路有关?在体内，红景天对梗死后心肌血管再生期的影响究竟是怎样进行的?为了对上述问题进行探讨，本研究首先采用鸡胚尿囊膜为研究模型，比较了红景天及其组方的促血管生长作用。然后以脐静脉内皮细胞为模型，研究红景天对内皮细胞血管生长相关基因的影响。最后制造大鼠急性心肌梗死模型，并用红景天干预后，探讨心肌梗死不同部位血管内皮生长因子受体VEGFR2、低氧诱导因子HIF1a、E26转化特定因子ETS1和生长分化因子GDF15以及ERK1／2磷酸化程度的改变。第一部分红景天及其组方促鸡胚尿囊膜血管生长作用的比较目的：1比较体外生药红景天及其组方五味方的促鸡胚尿囊膜血管生长作用；2探讨血清药理学研究的适当条件；3比较红景天含药血清和五味方含药血清的促鸡胚尿囊膜血管生长作用。方法：以鸡胚尿囊膜为研究模型，首先对红景天、中药A、中药B、中药C、中药D，每种中药有醇提和水提醇沉两种制剂，以及有红景天参与的五味方和无红景天参与的四味方的促血管生长作用进行比较。然后以五味方为工具药，并以具有确切促血管生长作用的麝香保心丸为对照，以动物喂药天数、喂药剂量、采血时间为主要研究因素，每个因素设4个观察水平，比较不同条件下得到的五味方含药血清和麝香保心丸含药血清促鸡胚尿囊膜血管生长作用的大小。优选出适合研究五味方含药血清促血管生长作用的一套参数，并在相同条件下制备红景天含药血清并与五味方进行比较。结果：1红景天较其组方五味方促鸡胚尿囊膜血管生长作用更强（血管计数18.88±1.959 vs 13.5±1.927，P＜0.05）。红景天醇提制剂和水提醇沉制剂的促血管生长作用无明显差异（血管计数18.88±1.959 vs 18.5±1.69，P=0.98）。2喂药天数和喂药剂量是血清药理学研究重要的影响因素，以五味方和麝香保心丸为研究药物制备的血清在5倍临床等效剂量喂药动物4天后采血，促鸡胚尿囊膜血管生长作用最强（P＜0.05）。采血时间以末次喂药后半小时采血得到的血清作用较强，但是与其它时间点比较后未达到统计学差异（P＞0.05）。血清是否灭活对其促血管生长作用无影响（P＞0.05），五味方含药血清的作用较麝香保心丸强（P＜0.05）。3比较5倍临床等效剂量喂药动物4天后得到的红景天血清和五味方血清，红景天含药血清较五味方含药血清的促鸡胚尿囊膜血管生长作用强（血管计数20.5±1 vs 16.5±0.55，P＜0.05）。结论：红景天较其组方的促血管生长作用强。第二部分红景天对脐静脉内皮细胞血管生长相关基因的影响目的：观察红景天对内皮细胞哪些血管生长相关基因有影响方法：首先用MTT法选择促脐静脉内皮细胞生长的适当的红景天药液浓度。在此浓度下处理内皮细胞24小时后收集细胞RNA，并以未用红景天药液培养的细胞作对照，进行GEArray Q Series Human Angiogenesis Gene Array检测。对结果选取有意义的基因用实时定量PCR法进行检测。结果：红景天药液在500ug／ml时促内皮细胞生长作用明显。在此浓度下处理的细胞与对照组进行比较，在96个血管生长相关基因中有50个基因上调＞2倍。其中涉及VEGF及其受体家族、FGF及其受体家族、TGFb及其受体家族、细胞因子和趋化因子CSF、TNF，核转录因子SMAD1、ETS1，细胞外基质蛋白酶MMP家族等多项与血管生长相关的基因家族。对其中的VEGFR2、ETS1、G-CSF、TNFa、TGFbR1、TGFbR2和SMAD1进行验证的结果与芯片结果一致，均上调＞2倍。结论：红景天对内皮细胞血管生长相关基因的影响是多因素多环节的，构成一个复杂的网络，其核心成员可能是VEGF、FGF和TGFb家族。第三部分：红景天对梗死后心肌血管再生期的影响目的：比较大鼠急性心肌梗死后2周内（梗死后1天、4天、7天和14天），心肌不同部位（梗死中央、梗死边缘和梗死远处）HIF1a、VEGFR2、ETS1和GDF15表达以及ERK1／2磷酸化程度的动态改变以及红景天干预后的结果。比较它们与梗死局部微血管密度以及心功能的关系。方法：结扎大鼠冠脉前降支进行急性心肌梗死造模。造模后分成红景天喂药组（3g／kg／d≈2ml）和生理盐水喂养组（2ml／d）。另设假手术组和正常大鼠组。在造模后24小时内开始喂药。喂药后1天、4天、7天和14天分批处死大鼠，每批4只红景天组，4只生理盐水组、4只假手术组和1只正常组。4天、7天和14天大鼠处死前经颈动脉插管检测LVP和dp／dt。大鼠处死后取出心脏，沿心脏长轴位切开，一半放入10％福尔马林保存，然后进行CD34免疫组化染色。另一半分别在梗死中央、边缘和远处取心肌组织即刻液氮保存。对上述组织用实时定量PCR法检测HIF1a、VEGFR2、ETS1和GDF15表达，Western blot法检测ERK1／2磷酸化程度。结果：1)未用红景天干预的生理盐水组和红景天组大鼠梗死心肌局部微血管密度随时间延长增加。生理盐水组从第7天开始微血管密度明显增加并持续到14天。红景天组从第4天开始微血管密度明显增加，同样持续到14天。从第4天开始到14天，红景天组的微血管密度均大于生理盐水组。假手术组在14内微血管密度无动态改变。2)红景天对心肌表达HIF1a和VEGFR2／KDR的影响基本一致。VEGFR2的表达在心梗后未用红景天干预的情况下，从相同部位的时间变化上看，在梗死中央、梗死边缘和梗死远处都是第4天开始VEGFR2表达增加并持续到第14天。在梗死中央区域是14天达最高水平；在梗死边缘和梗死远处是第4天时表达最高，以后略下降，但至14天时表达仍较1天时高。从相同时间的不同部位来看，第1天和第14天各部位表达无明显差异。第4天和第7天表达从高到低均是梗死远处＞梗死边缘＞梗死中央。在用红景天干预的情况下，从相同部位的时间变化上来看，在梗死中央和梗死边缘都是从第4天开始表达增加并持续到第14天。在梗死中央是第7天表达最高，在梗死边缘是第14天表达最高。在梗死远处是第7天表达最高，第4天和第14天较第1天无明显差异。两组比较可见红景天对大鼠梗死心肌的影响主要在第7天和第14天。第7天时对各部位都有上调的作用，第14天时主要是梗死边缘部位表达上调。3)在HIF1a的表达上来看，在心梗后未用红景天干预的情况下，各部位从第4天开始表达有增加趋势且持续到第14天，但是均未达到统计学差异。在相同时间内比较不同部位的表达。第1天和第14天时梗死边缘分别是梗死中央的3.92倍和3.48倍。第4天和第7天各部位比较无明显差异。在红景天组，在各部位都是从第4天开始表达增加。在梗死中央和梗死边缘都是第7天表达最高，分别是第1天的4.8倍和4.65倍。在梗死远处，从第4天开始有增高趋势但未达到统计学差异。比较相同时间内不同部位的表达。在各时间点，均以梗死边缘的表达较高，第1天、第4天、第7天和第14天梗死边缘表达分别是梗死中央的1.34倍，1.41倍，1.3倍和2.5倍，但是均未达到统计学差异。两组比较，红景天对梗死心肌的影响主要在梗死后第7天的梗死中央和梗死边缘，分别是生理盐水组的4.72倍和2.86倍。4)在ETS1的表达上，在心梗后未用红景天干预的情况下，从相同部位的时间变化上来看，在梗死中央和梗死远处各时间点无明显差异。在梗死边缘从第4天开始表达增加且持续到第14天，在第14天表达最高。从相同时间的不同部位来看，第1天、第7天和第14天都是梗死远处表达最高，其次是梗死边缘，梗死中央表达最低。第4天时梗死边缘表达最高，其次是梗死远处，梗死中央表达最低。在心梗后用红景天干预后，从相同部位的时间变化上来看，在梗死中央和梗死边缘都是从第4天开始表达增加且持续到第14天，都是在第7天时表达最高。在梗死远处各时间点无明显差异。从相同时间的不同部位来看，情况同生理盐水组。两组比较，可见红景天对梗死心肌的影响主要在梗死后第4天的梗死边缘和梗死后第7天的梗死中央及梗死边缘，都是上调的作用。5)而GDF15在心肌内的表达情况，两组比较，红景天组对心肌GDF15表达的影响主要集中在4天的梗死边缘和7天的梗死远处，均为上调的作用。6) GDF15在心梗后未用红景天干预的情况下，梗死中央和梗死边缘的表达都是在第14天时表达最高。而用红景天干预后是第4天时这两个部分的表达最高。无论是否用红景天干预，在第1天和第7天都是梗死远处表达最高，其次是梗死边缘，梗死中央表达最低。在第4天和第14天都是梗死边缘表达最高，其次是梗死远处，梗死中央表达还是最低。7)ERK磷酸化情况：红景天组在1天和4天时对梗死心肌不同部位ERK1／2磷酸化情况影响较大。1天时红景天组在梗死中央、边缘和远处的表达均高于生理盐水组。4天时，在梗死中央和边缘较生理盐水组高，而梗死远处生理盐水组较红景天组高。结论：在急性心肌梗死后，HIF1a、VEGFR2和和ETS1在心肌不同部位的表达不同。随时间变化，在梗死区内变化较小。在梗死边缘和梗死远处都有上升趋势。红景天对梗死后心肌血管再生期的影响，主要集中在炎症反应期。红景天对梗死中央、边缘和远处均有不同程度的影响。对梗死边缘的影响较大。GDF15与梗死后心功能改善情况一致。但是红景天对梗死心肌GDF15的影响较心功能改善出现早，红景天是否通过促进GDF15的表达来改善心功能有待进一步研究。急性心肌梗死后在炎症反应初期ERK1／2磷酸化程度较高，与促血管生长相关基因HIF1a、VEGFR2和和ETS1的表达趋势不一致。对在梗死心肌ERK1／2磷酸化程度的影响，血管再生可能不是主要影响因素。红景天对ERK1／2磷酸化程度的影响主要在炎症反应期。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 红景天及其组方促鸡胚尿囊膜血管生长作用的比较研究
• 实验一 抗心肌缺血中药及其组方促鸡胚尿囊膜血管生长作用的比较研究
• 材料和方法
• 结果
• 实验二 五味方含药血清促鸡胚尿囊膜血管生长影响因素的研究
• 材料和方法
• 结果
• 实验三 红景天含药血清五味方含药血清与促鸡胚尿囊膜血管生长作用的比较
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 红景天对脐静脉内皮细胞血管生长相关基因影响的研究
• 实验一 MTT法检测不同浓度红景天药液对脐静脉内皮细胞生长的影响
• 材料和方法
• 结果
• 实验二 红景天对脐静脉内皮细胞促血管生长相关基因的影响
• 材料和方法
• 结果
• 实验三 实时定量PCR方对实验二结果进行验证
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 红景天对梗死后心肌在血管再生期的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述