玉米C组促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因ZmMPK7的分离及功能分析

论文摘要

MAPK级联途径是存在于真核生物中进化上保守的信号通路,在细胞信号的转换和放大过程中起重要作用。MAPK级联途径由三个成员组成,分别是MAPK、MAPKK （MAPK kinase）及MAPKKK（MAPKK kinase）,此三个信号组分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的方式依次磷酸化将外源信号级联放大向下传递。植物中的MAPK通常分为四组,即A, B, C, D。关于A, B组MAPK的报道较多,研究较为详细。关于C组MAPK的分析较为欠缺。但近年研究发现,C组MAPK同样参与介导环境胁迫及信号分子（如ABA, H2O2等）的传递。由于不同物种中C组MAPK编码基因相继报道,所以有理由推测不同物种间C组MAPK调控的信号转导通路可能存在某些相似性。玉米作为一种重要的禾本科粮食作物,其C组MAPK基因迄今未见报道。ABA,H2O2是植物逆境信号转导中重要的信号分子, C组MAPK是否介导这两种信号的传递?与抗氧化系统关系如何?这一问题亟待回答。本研究从玉米栽培种鲁单50幼苗中分离到一个C组MAPK基因,命名为ZmMPK7,对其序列特征、表达模式、以及过表达转基因烟草的抗逆生理功能做了初步研究。主要结果如下:1. GenBank中玉米MAPK基因信息的收集及整理根据拟南芥20个MAPK的基因序列,逐一在GenBank中比对,共得到39条玉米序列的信息。其中许多基因序列存在重复提交的现象。经分析后共保留下12条特异的基因全序列,它们都具有植物MAPK的序列特征,分属于四组,即A, B, C, D。其中C,D组成员占大多数,由此推测C,D组MAPK的多样性可能与其介导信号转导的特异性有关。2.玉米C组MAPK基因ZmMPK7的分离及序列分析根据玉米MAPK基因信息分析结果,设计特异引物从玉米幼苗中特异性扩增DNA片段。该扩增片段包含一个1113bp的ORF,编码370个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.5kD,命名为ZmMPK7。序列分析显示,ZmMPK7包含11个植物MAPK保守的Ser/Thr蛋白激酶亚区以及一个TEY基序。进化树分析显示其与水稻OsMSRMK3,拟南芥ATMPK1、ATMPK2、ATMPK7、ATMPK14,烟草NtNTF3及豌豆PsMPK2的同源性较高,属于C组MAPK。3. ZmMPK7的表达分析为了研究ZmMPK7对不同胁迫刺激的响应模式,我们首先进行Northern blot分析。ZmMPK7具有较高的本底水平表达,100μM ABA或1.5 mM H2O2明显诱导该基因的表达,而PEG-6000及4oC低温处理未能检测到该基因的诱导表达。ABA及H2O2对该基因的诱导呈现不同的时间效应,并且依赖于Ca2+的存在。Imidazole、Tiron及DMTU为ROS效应剂,其中Imidazole是NADPH oxidase的抑制剂,而Tiron及DMTU是细胞内源ROS淬灭剂。使用以上药剂预处理玉米幼苗,半定量RT-PCR分析显示不同程度地抑制了ABA对ZmMPK7的诱导表达。正常生长状态下的玉米幼苗,ZmMPK7的本底表达呈现稳态水平,未检测到节律周期性。4.过表达ZmMPK7的转基因烟草在渗透胁迫下抗氧化能力增强为进一步研究ZmMPK7在介导ABA、H2O2信号转导过程中的详细功能,本研究构建该基因的正义过表达载体,农杆菌介导法转化烟草,挑取T3代纯合阳性转基因株系及野生型烟草进行生理分析。发现渗透胁迫下转基因烟草各株系内H2O2及丙二醛（MDA）积累量较野生型烟草少。以PEG-6000模拟渗透胁迫处理烟草,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的总酶活在转基因烟草和野生型烟草中未检测到明显差异,而过表达ZmMPK7显著增强了转基因烟草的过氧化物酶（POD）及抗坏血酸过氧化物酶（APX）总酶活。转基因烟草各株系的总抗坏血酸（AsA）及脱氢抗坏血酸（DAsA）含量明显高于野生型烟草。根据以上证据有理由推测过表达ZmMPK7的转基因烟草抗氧化系统得以改善,渗透胁迫下受到的氧化伤害较轻。此外,利用不同浓度的甲基紫精（MV）模拟氧化胁迫,分析烟草幼苗生长受到的影响。结果显示转基因各株系在较高或较低浓度的MV处理培养基中,均表现为较好的长势。该证据再次说明过表达ZmMPK7的转基因烟草在耐受氧化胁迫方面的优势。5. ZmMPK7定位于细胞核生物信息学软件预测ZmMPK7细胞核内定位的几率较高,瞬时转化ZmMPK7-GFP于洋葱表皮细胞的实验验证了该推测,即ZmMPK7为细胞核定位。6.玉米B组MAPKK基因ZmMKK3的分离及序列分析按照前文相似的分析方式,对GenBank中关于玉米MAPKK推测的基因信息收集整理,根据整理结果设计特异引物,从玉米幼苗中分离到一段DNA序列,该序列具有植物MAPKK的序列特征,包含有1572bp的ORF,编码523个氨基酸,将其命名为ZmMKK3。序列分析显示ZmMKK3含有所有植物MAPKK的保守氨基酸亚区以及磷酸化一致序列S/TxxxxxS/T。进化树分析显示与水稻OsMKK3、拟南芥AtMKK3同源性最高,同属于B组MAPKK。由于已有文献证明拟南芥AtMKK3是C组MAPK的上游激酶,与拟南芥AtMPK7直接互作。所以根据序列同源性分析,我们推测玉米ZmMKK3与ZmMPK7可能也存在互作关系。此推测尚需进一步验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物 MAPK Cascades 的组成
• 1.1.1 植物中的MAPKKK
• 1.1.2 植物中的MAPKK
• 1.1.3 植物中的MAPK
• 1.1.3.1 植物MAPK 的结构、分类及功能
• 1.1.3.2 植物中的C 组MAPK
• 1.2 MAPK Cascades 介导的信号转导途径
• 1.2.1 非生物胁迫及生物胁迫信号转导途径汇集于MAPK Cascades
• 1.2.2 MAPK Cascades 与植物激素信号转导
• 1.2.2.1 MAPKCascades 参与调控乙烯信号转导过程
• 1.2.2.2 MAPK Cascades 参与调控生长素信号转导过程
• 1.2.2.3 MAPK Cascades 参与调控ABA 信号转导过程
• 1.2.2.3.1 MAPK Cascades 参与调控保卫细胞ABA 的信号转导
• 1.2.2.3.2 MAPK Cascades 参与抑制种子萌发及萌发后生长的ABA 信号转导
• 2O₂介导的ABA 信号转导'>1.2.2.3.3 MAPK Cascades 参与调控H₂O₂介导的ABA 信号转导
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 培养基
• 2.2 材料处理
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 植物材料总RNA 的提取
• 2.3.2 去除RNA 样品中的基因组污染
• 2.3.3 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.3.4 PCR 扩增
• 2.3.5 连接反应
• 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.3.8 碱法小量质粒DNA 的提取
• 2.3.9 DNA 序列测定
• 2.3.10 Northern 杂交分析
• 2.3.10.1 总RNA 的提取
• 2.3.10.2 甲醛变性胶电泳
• 2.3.10.3 转膜
• 2.3.10.4 预杂交
• 2.3.10.5 探针的制备
• 2.3.11 半定量RT-PCR
• 2.3.12 实时定量RT-PCR
• 2.3.13 基因组DNA 提取（SDS 法）
• 2.3.14 原核表达玉米ZmMPK7 蛋白
• 2.3.14.1 原核表达载体的构建
• 2.3.14.2 大肠杆菌BL21 原核表达的诱导
• 2.3.14.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.3.14.4 重组蛋白的纯化
• 2.3.15 原核表达玉米ZmMPK7 重组蛋白抗体制备
• 2.3.16 Western blot 检测蛋白表达
• 2.3.16.1 蛋白质提取及含量测定
• 2.3.16.2 转膜
• 2.3.17 ZmMPK7 的亚细胞定位
• 2.3.18 转烟草正义表达载体的构建
• 2.3.19 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.3.19.1 感受态细胞的制备
• 2.3.19.2 冻融法农杆菌转化
• 2.3.20 农杆菌介导的烟草转化
• 2.3.21 转基因烟草的鉴定
• 2.3.21.1 基因组水平鉴定
• 2.3.21.2 转录水平鉴定
• 2.3.21.3 蛋白水平鉴定
• 2O₂积累'>2.3.22 组织化学水平检测 H₂O₂积累
• 2.3.23 植物抗氧化酶活力及丙二醛含量的测定
• 2.3.24 植物同功酶电泳分析
• 2.3.25 植物抗坏血酸含量的测定
• 2.3.26 叶片气体交换参数的测定
• 2.3.27 荧光参数的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 GenBank 中玉米 MAPK 基因信息的收集及整理
• 3.1.1 GenBank 中玉米 MAPK 基因信息的收集
• 3.1.2 玉米MAPK 基因的系统发生关系
• 3.2 玉米 C 组 MAPK 基因 ZmMPK7 的分离
• 3.3 玉米MAPK 基因ZmMPK7 的序列分析
• 3.4 ZmMPK7 表达特性分析
• 3.4.1 ZmMPK7 对不同胁迫及信号物质的响应模式
• 2O₂对ZmMPK7 的诱导存在交叉'>3.4.2 ABA、H₂O₂对ZmMPK7 的诱导存在交叉
• 3.4.3 正常条件下培养的玉米幼苗材料未检测到ZmMPK7 基因的节律性表达
• 3.5 ZmMPK7 在大肠杆菌中的表达及抗体的制备
• 3.5.1 原核表达载体的构建
• 3.5.2 重组蛋白的表达及诱导条件的优化
• 3.5.3 pET30a-ZmMPK7 重组蛋白的亲和纯化及抗体的制备
• 3.6 ZmMPK7 的亚细胞定位
• 3.6.1 植物表达载体 pBI221-ZmMPK7-EGFP 的构建
• 3.6.2 ZmMPK7 定位于细胞核中
• 3.7 过表达ZmMPK7 的转基因烟草的生理分析
• 3.7.1 转基因烟草表达载体 pBI121-ZmMPK7 的构建
• 3.7.2 转基因烟草的筛选鉴定
• 3.7.3 渗透胁迫条件下过表达ZmMPK7 转基因烟草的活性氧水平明显降低
• 3.7.4 过表达ZmMPK7 改善了转基因烟草的酶促抗氧化系统
• 3.7.5 过表达 ZmMPK7 转基因烟草在渗透胁迫下光合能力得到改善
• 3.8 玉米 ZmMPK7 上游互作组分的研究
• 3.8.1 关于ZmMPK7 上游互作组分的文献分析
• 3.8.2 玉米ZmMKK3 基因的分离
• 3.8.3 ZmMKK3 的序列分析及系统发生关系
• 4 讨论
• 4.1 玉米中的MAPKs
• 2O₂的信号转导'>4.2 玉米C 组MAPK 基因ZmMPK7 参与ABA、H₂O₂的信号转导
• 4.3 过表达ZmMPK7 的转基因烟草在渗透胁迫下抗氧化能力提高
• 4.4 ZmMPK7 的亚细胞定位
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 附：论文发表情况
• 致谢