论文摘要
[目的]:研究腺病毒介导的重组IL2-KDRscFv、IL2-sTRAIL（114-281aa）及IL2- KDRscFv-sTRAIL对胃癌SGC-7901细胞、肝癌HepGII细胞、大肠癌SW480细胞及人正常肝细胞株LO2的杀伤作用,以及对裸鼠肿瘤体积、肿瘤微血管生成的抑制作用,观察KDRscFv融合sTRAIL是否有协同抗瘤效果,为应用TRAIL进行肿瘤基因治疗提供实验基础。[方法]:采用重叠延伸PCR方法,分别在KDRscFv及sTRAIL（114-281aa）基因的N端融合IL2信号肽基因,以提高蛋白表达的可溶性。然后采用基因融合技术,构建IL2-KDRscFv与sTRAIL的融合基因。根据细菌内同源重组原理,首先构建编码TRAIL胞外区114281位氨基酸、编码KDR单链抗体及编码二者融合基因的腺病毒穿梭质粒pAd-IL2-KDRscFv、pAd-IL2-sTRAIL及pAd-IL2-KDRscFv-sTRAIL,酶切线性化后转染BJ5183菌,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内发生同源重组,将阳性重组子转染HEK293人胚肾细胞,获得高滴度的重组病毒颗粒后,转导人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株HepGII和结肠癌细胞株SW480以及人正常肝细胞株LO2,并采用荷瘤裸鼠瘤体内注射的方法,通过流式细胞仪、MTT、Western印迹法和免疫组化等方法测定重组腺病毒介导的目的蛋白在体内外的表达及观察肿瘤细胞的凋亡诱导作用和对肿瘤体积、肿瘤血管生成的抑制作用。[结果]:（1）成功地获得了三种重组腺病毒,在293细胞中大量扩增后,经氯化铯纯化浓缩后病毒滴度可达1012vp/ml。且均对真核细胞有高效感染效率。（2）三种重组腺病毒对SGC-7901、SW480和HepGII细胞均有一定程度的凋亡诱导作用,其中以重组Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL腺病毒的作用最为明显。在感染复数为20,作用48小时情况下,可诱导39.16%的肝癌HepGII细胞发生凋亡,与PBS及Ad-GFP对照组相比,结果具有显著统计学差异。（3）三种肿瘤细胞中,以肝癌HepGII细胞对负载有目的基因的腺病毒最为敏感,在感染复数为20,作用48小时情况下,Ad-IL2-sTRAIL可诱导19.88%、Ad-KDRsvFv可诱导9.09%的HepGII细胞凋亡,同样条件下胃癌SGC-7901细胞的凋亡率分别为8.09%、5.75%。（4）三种腺病毒对人正常肝细胞LO2无明显凋亡诱导作用,与PBS对照及Ad-GFP载体对照组相比,结果无显著差别。（5）三种腺病毒感染肿瘤细胞后,在细胞培养上清及收集的细胞沉淀中均可检测到目的蛋白的表达。（6）体内实验中,瘤体内注射重组腺病毒,可明显抑制肿瘤体积增长,以Ad-IL-2-KDRscFv-sTRAIL腺病毒的作用最为明显,抑瘤率达75.60±4.8891%,而Ad-IL2-sTRAIL及Ad-IL2-KDRscFv的抑瘤率分别为63.69±6.6706%和56.17±7.3983%。（7）瘤体内注射重组腺病毒,可使肿瘤组织微血管密度减少,以Ad-IL2 -KDRscFv-sTRAIL腺病毒的作用最为明显,与其它治疗组及对照组相比,结果具显著统计学差异。（8）瘤体内注射腺病毒,仅在肝组织及肿瘤组织中检测到目的蛋白的表达,心、脾、肾、小肠、肺等组织为阴性表达。（9）各组裸鼠的肝脏组织及其他组织经病理切片观测,未见到明显的病理改变。[结论]:（1）重组腺病毒介导的IL2-KDRscFv、IL2-sTRAIL（114-281aa）及IL2-KDRscFv- sTRAIL对胃癌SGC-7901细胞、肝癌HepGII细胞及大肠癌SW480细胞均有杀伤作用,其中以Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL对肿瘤细胞的凋亡诱导能力最强。（2）体外实验证实,我们构建的三种腺病毒对人正常肝细胞株LO2是安全的。（3）瘤体内注射腺病毒,可明显抑制肿瘤生长及肿瘤微血管生成,以Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL的作用最为显著,说明KDRscFv融合sTRAIL基因既可杀伤肿瘤细胞,又可抗肿瘤血管生成,从不同方面发挥协同抗肿瘤作用。（4） Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL、Ad-IL2-sTRAIL及Ad-IL2-KDRscFv对心、肝、肾、脾、肺及小肠等组织无明显毒性,瘤体内注射是安全的。
论文目录
相关论文文献
- [1].抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定[J]. 胃肠病学和肝病学杂志 2008(06)
- [2].VEGF受体单抗与Luffin双靶融合毒素的构建及其对非小细胞肺癌细胞的抑制作用[J]. 第三军医大学学报 2013(18)